核酸的实验优秀课件.ppt

核酸的核酸的实验第1页，本讲稿共18页实验实验1 1 动物肝细胞内动物肝细胞内DNADNA和和RNARNA 的提取和分离的提取和分离实验目的实验目的实验目的实验目的初步掌握从组织中分离和提纯初步掌握从组织中分离和提纯初步掌握从组织中分离和提纯初步掌握从组织中分离和提纯DNADNA与与与与RNARNA的原理和方法。的原理和方法。的原理和方法。的原理和方法。实验原理实验原理实验原理实验原理细胞中核酸以细胞中核酸以细胞中核酸以细胞中核酸以DNPDNP，RNPRNP形式存在形式存在形式存在形式存在，而，而，而，而DNP,RNPDNP,RNP在不同在不同在不同在不同浓度的氯化钠溶液中浓度的氯化钠溶液中浓度的氯化钠溶液中浓度的氯化钠溶液中溶解度不同溶解度不同溶解度不同溶解度不同。DNPDNP在在在在0.14mol/LNaCl0.14mol/LNaCl中中中中溶解度溶解度溶解度溶解度最低最低最低最低，而，而，而，而RNPRNP却却却却易溶解易溶解易溶解易溶解，故用，故用，故用，故用0.14mol/LNaCl0.14mol/LNaCl洗涤组洗涤组洗涤组洗涤组织匀浆，可得到织匀浆，可得到织匀浆，可得到织匀浆，可得到DNPDNP，再用，再用，再用，再用SDSSDS、氯仿、氯仿、氯仿、氯仿-异戊醇异戊醇异戊醇异戊醇除蛋白，乙醇除蛋白，乙醇除蛋白，乙醇除蛋白，乙醇沉淀后即可得到沉淀后即可得到沉淀后即可得到沉淀后即可得到DNADNA。RNARNA的分离提纯目前多用的分离提纯目前多用的分离提纯目前多用的分离提纯目前多用酚仿抽提法酚仿抽提法酚仿抽提法酚仿抽提法。组织匀浆在。组织匀浆在。组织匀浆在。组织匀浆在苯酚与苯酚与苯酚与苯酚与氯仿氯仿氯仿氯仿存在下，存在下，存在下，存在下，RNARNA与变性蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，与变性蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，与变性蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，与变性蛋白质分离。酚使蛋白质变性凝固，RNARNA溶解在水相中，用乙醇使溶解在水相中，用乙醇使溶解在水相中，用乙醇使溶解在水相中，用乙醇使RNARNA从水相中沉淀而达到分离。从水相中沉淀而达到分离。从水相中沉淀而达到分离。从水相中沉淀而达到分离。分离核酸分离核酸分离核酸分离核酸提纯核酸（提纯核酸（提纯核酸（提纯核酸（SDSSDS，苯酚，氯仿），苯酚，氯仿），苯酚，氯仿），苯酚，氯仿）乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀乙醇沉淀测定测定测定测定第2页，本讲稿共18页仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂仪器仪器仪器仪器:研钵、离心机、研钵、离心机、研钵、离心机、研钵、离心机、天平、玻璃棒、恒温水浴锅、天平、玻璃棒、恒温水浴锅、天平、玻璃棒、恒温水浴锅、天平、玻璃棒、恒温水浴锅、25ml25ml容容容容量瓶、量瓶、量瓶、量瓶、50ml50ml容量瓶及实验常用器皿容量瓶及实验常用器皿容量瓶及实验常用器皿容量瓶及实验常用器皿（约（约（约（约1111个离心管）个离心管）个离心管）个离心管）试剂试剂试剂试剂:0.14mol/L0.14mol/L氯化钠氯化钠氯化钠氯化钠-0.05mol/L-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液柠檬酸钠缓冲液(含含含含1mmol/LEDTA)1mmol/LEDTA)、10%10%氯化钠溶液、氯仿氯化钠溶液、氯仿氯化钠溶液、氯仿氯化钠溶液、氯仿-异戊醇溶液异戊醇溶液异戊醇溶液异戊醇溶液（24:124:1）、）、）、）、20%20%十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）、）、）、）、95%95%乙醇乙醇乙醇乙醇（预冷）（预冷）（预冷）（预冷）、苯酚、苯酚、苯酚、苯酚-氯仿氯仿氯仿氯仿-异戊醇醇溶液（异戊醇醇溶液（异戊醇醇溶液（异戊醇醇溶液（25:24:1)25:24:1)、0.1mol/L 0.1mol/L 氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液第3页，本讲稿共18页 实验操作实验操作(一一一一)DNP)DNP与与与与RNPRNP的分离的分离的分离的分离11、取新鲜肝脏，用表面皿称取取新鲜肝脏，用表面皿称取取新鲜肝脏，用表面皿称取取新鲜肝脏，用表面皿称取0.5g0.5g，用，用，用，用0.14mol/L0.14mol/L氯化钠氯化钠氯化钠氯化钠-0.05mol/L-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（含柠檬酸钠缓冲液（含柠檬酸钠缓冲液（含柠檬酸钠缓冲液（含1mmol/LEDTA1mmol/LEDTA）冲洗除去血）冲洗除去血）冲洗除去血）冲洗除去血水。洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中，边滴加缓冲液边研磨水。洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中，边滴加缓冲液边研磨水。洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中，边滴加缓冲液边研磨水。洗净后立即将肝脏置于冰浴研钵中，边滴加缓冲液边研磨(加入加入2ml），至匀浆状，转移至离心管中，每次用），至匀浆状，转移至离心管中，每次用），至匀浆状，转移至离心管中，每次用），至匀浆状，转移至离心管中，每次用0.5ml0.5ml缓冲缓冲缓冲缓冲液冲洗研钵至离心管，液冲洗研钵至离心管，液冲洗研钵至离心管，液冲洗研钵至离心管，3 3次。次。次。次。（研磨时间不要超过（研磨时间不要超过（研磨时间不要超过（研磨时间不要超过30min30min）2 2、匀浆液于匀浆液于匀浆液于匀浆液于3000r/min3000r/min离心离心离心离心15min15min，上清液中即含上清液中即含上清液中即含上清液中即含RNPRNP，沉淀中含沉淀中含沉淀中含沉淀中含DNPDNP。33、将上清液倒入另一支离心管将上清液倒入另一支离心管将上清液倒入另一支离心管将上清液倒入另一支离心管。再往上述沉淀中加入。再往上述沉淀中加入。再往上述沉淀中加入。再往上述沉淀中加入3.5ml3.5ml缓冲溶液，同样离心缓冲溶液，同样离心缓冲溶液，同样离心缓冲溶液，同样离心15min15min，取上清液倒入另一离心管取上清液倒入另一离心管取上清液倒入另一离心管取上清液倒入另一离心管。向向向向DNPDNP沉淀加入沉淀加入沉淀加入沉淀加入3ml10%3ml10%氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内，使氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内，使氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内，使氯化钠溶液，摇匀，置于冰箱内，使DNPDNP充分溶解，留至下午用。充分溶解，留至下午用。充分溶解，留至下午用。充分溶解，留至下午用。第4页，本讲稿共18页（二）（二）（二）（二）RNARNA的提取的提取的提取的提取1 1、各向两支、各向两支、各向两支、各向两支RNARNA上清液离心管加入与清液等体积的上清液离心管加入与清液等体积的上清液离心管加入与清液等体积的上清液离心管加入与清液等体积的酚仿醇酚仿醇酚仿醇酚仿醇溶液（溶液（溶液（溶液（2525：2424：1 1），剧烈震荡），剧烈震荡），剧烈震荡），剧烈震荡10min10min，平衡后，平衡后，平衡后，平衡后30003000r/minr/min离心离心离心离心15min15min。重复操作，直到离心后两相之间无明。重复操作，直到离心后两相之间无明。重复操作，直到离心后两相之间无明。重复操作，直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。（一般重复一次即可）显变性蛋白为止。（一般重复一次即可）显变性蛋白为止。（一般重复一次即可）显变性蛋白为止。（一般重复一次即可）2 2、再取两支离心管再取两支离心管再取两支离心管再取两支离心管各加入各加入各加入各加入约上层水相约上层水相约上层水相约上层水相2.52.5倍体积倍体积倍体积倍体积的的的的预冷预冷预冷预冷95%95%乙醇，乙醇，乙醇，乙醇，将两支管的水相对应滴入将两支管的水相对应滴入将两支管的水相对应滴入将两支管的水相对应滴入，摇匀摇匀摇匀摇匀，置于冰箱内静置置于冰箱内静置置于冰箱内静置置于冰箱内静置20min20min，3000r/min15min3000r/min15min离心，后用蒸馏水多次离心，后用蒸馏水多次离心，后用蒸馏水多次离心，后用蒸馏水多次润洗沉润洗沉润洗沉润洗沉淀淀淀淀至烧杯，并定容至至烧杯，并定容至至烧杯，并定容至至烧杯，并定容至50ml.50ml.第5页，本讲稿共18页（三）（三）（三）（三）DNADNA的提取的提取的提取的提取1 1、下午，从冰箱取出下午，从冰箱取出下午，从冰箱取出下午，从冰箱取出DNPDNP样液，样液，样液，样液，加入约加入约加入约加入约2ml2ml氯仿氯仿氯仿氯仿-异戊醇溶液异戊醇溶液异戊醇溶液异戊醇溶液（24:124:1）和）和）和）和0.5ml20%SDS0.5ml20%SDS，上下振荡上下振荡上下振荡上下振荡10min10min（注意不要（注意不要（注意不要（注意不要过于剧烈）过于剧烈）过于剧烈）过于剧烈），于，于，于，于3000r/min3000r/min离心离心离心离心15min15min，吸取上面含，吸取上面含，吸取上面含，吸取上面含DNADNA和和和和DNPDNP的水层至另一离心管，弃去中间蛋白层和下层液体。的水层至另一离心管，弃去中间蛋白层和下层液体。的水层至另一离心管，弃去中间蛋白层和下层液体。的水层至另一离心管，弃去中间蛋白层和下层液体。3 3、再次向取出的上层水相加入约、再次向取出的上层水相加入约、再次向取出的上层水相加入约、再次向取出的上层水相加入约1/21/2体积体积体积体积氯仿氯仿氯仿氯仿-异戊醇溶液，异戊醇溶液，异戊醇溶液，异戊醇溶液，振荡振荡振荡振荡，离心，继续抽提，离心，继续抽提，离心，继续抽提，离心，继续抽提，直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。直到离心后两相之间无明显变性蛋白为止。（一般重复一次即可）（一般重复一次即可）（一般重复一次即可）（一般重复一次即可）4 4、取两支离心管取两支离心管取两支离心管取两支离心管各加入各加入各加入各加入约与离心后上层水约与离心后上层水约与离心后上层水约与离心后上层水相等体积相等体积相等体积相等体积的的的的预冷预冷预冷预冷95%95%乙醇，乙醇，乙醇，乙醇，将水相分两等份将水相分两等份将水相分两等份将水相分两等份滴入滴入滴入滴入，边滴边，边滴边，边滴边，边滴边搅拌搅拌搅拌搅拌，后于冰箱内静置后于冰箱内静置后于冰箱内静置后于冰箱内静置20min20min，挑出絮状，挑出絮状，挑出絮状，挑出絮状DNADNA至至至至烧杯，再将溶液烧杯，再将溶液烧杯，再将溶液烧杯，再将溶液3000r/min15min3000r/min15min离心，倒去乙醇，用氢氧离心，倒去乙醇，用氢氧离心，倒去乙醇，用氢氧离心，倒去乙醇，用氢氧化钠多次化钠多次化钠多次化钠多次润洗沉淀润洗沉淀润洗沉淀润洗沉淀至上述烧杯，溶解完全后定容至至上述烧杯，溶解完全后定容至至上述烧杯，溶解完全后定容至至上述烧杯，溶解完全后定容至25ml.25ml.第6页，本讲稿共18页实验实验2地衣酚法测定地衣酚法测定RNARNA含量含量实验目的实验目的实验目的实验目的掌握用地衣酚法测定掌握用地衣酚法测定掌握用地衣酚法测定掌握用地衣酚法测定RNARNA含量的原理和方法。含量的原理和方法。含量的原理和方法。含量的原理和方法。实验原理实验原理实验原理实验原理核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖核糖核酸与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糖醛，后者与地衣酚（即继而转变成糖醛，后者与地衣酚（即继而转变成糖醛，后者与地衣酚（即继而转变成糖醛，后者与地衣酚（即3 3，55二羟基甲苯，二羟基甲苯，二羟基甲苯，二羟基甲苯，或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜或苔黑酚）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氯化铜作催化剂，反应产物在作催化剂，反应产物在作催化剂，反应产物在作催化剂，反应产物在670nm670nm处有最大吸收，处有最大吸收，处有最大吸收，处有最大吸收，RNARNA浓度浓度浓度浓度在在在在20250ug/ml20250ug/ml范围内，光密度与范围内，光密度与范围内，光密度与范围内，光密度与RNARNA浓度成正比。地衣浓度成正比。地衣浓度成正比。地衣浓度成正比。地衣酚反应特异性差，凡是戊糖均有此反应。样品中少量酚反应特异性差，凡是戊糖均有此反应。样品中少量酚反应特异性差，凡是戊糖均有此反应。样品中少量酚反应特异性差，凡是戊糖均有此反应。样品中少量DNADNA存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在含量高时会干扰测存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在含量高时会干扰测存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在含量高时会干扰测存在对测定无干扰，蛋白质、粘多糖在含量高时会干扰测定。定。定。定。第7页，本讲稿共18页仪器和试剂仪器和试剂仪器和试剂仪器和试剂11、仪器：、仪器：、仪器：、仪器：可见分光光度计、移液管、恒温水浴锅可见分光光度计、移液管、恒温水浴锅可见分光光度计、移液管、恒温水浴锅可见分光光度计、移液管、恒温水浴锅22、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：（1 1）100ug/mL100ug/mL标准标准标准标准RNARNA溶液溶液溶液溶液：称取：称取：称取：称取10mg10mg纯纯纯纯RNARNA用少用少用少用少量水溶解量水溶解量水溶解量水溶解(若不溶可用若不溶可用若不溶可用若不溶可用0.1mol0.1molLNaOHLNaOH溶液溶解，后加溶液溶解，后加溶液溶解，后加溶液溶解，后加等量等量等量等量0.1mol0.1molLHCLLHCL溶液调至溶液调至溶液调至溶液调至pH7.0)pH7.0)，定容至，定容至，定容至，定容至100mL100mL。（2 2）地衣酚试剂：地衣酚试剂：地衣酚试剂：地衣酚试剂：取取取取0.1gFeCl0.1gFeCl336H6H2 2OO溶于溶于溶于溶于100mL100mL浓浓浓浓HClHCl配制成配制成配制成配制成0.1%0.1%三氯化铁浓盐酸溶液。使用前再用上述溶液为三氯化铁浓盐酸溶液。使用前再用上述溶液为三氯化铁浓盐酸溶液。使用前再用上述溶液为三氯化铁浓盐酸溶液。使用前再用上述溶液为溶剂加入溶剂加入溶剂加入溶剂加入0.1g0.1g地衣酚配成地衣酚配成地衣酚配成地衣酚配成0.1%0.1%的地衣酚溶液。（临用时配的地衣酚溶液。（临用时配的地衣酚溶液。（临用时配的地衣酚溶液。（临用时配制）制）制）制）（3 3）样品待测液样品待测液样品待测液样品待测液：用上述实验方法提取的：用上述实验方法提取的：用上述实验方法提取的：用上述实验方法提取的RNARNA样品样品样品样品第8页，本讲稿共18页试试 管管0 01 12 23 34 45 5100100g/mLg/mL标准标准RNARNA溶液溶液/mL/mL0 00.40.40.80.81.21.21.61.62.02.0蒸馏水蒸馏水/mL/mL2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.40 0地衣酚溶液地衣酚溶液/mL/mL2.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.02.0摇匀，置沸水浴中煮25 min(严格控制时间）严格控制时间），冷却后（水浴冷却（水浴冷却5 5分钟后直接测量），分钟后直接测量），在670 nm波长处测各管光密度值光密度值光密度值00.0550.1280.1760.2320.289实验操作实验操作实验操作实验操作1 1、RNARNA标准曲线的制作标准曲线的制作标准曲线的制作标准曲线的制作(空白调零）空白调零）空白调零）空白调零）此步省略此步省略此步省略此步省略取取取取6 6支试管，按下表操作。以支试管，按下表操作。以支试管，按下表操作。以支试管，按下表操作。以RNARNA浓度为横坐标，光浓度为横坐标，光浓度为横坐标，光浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。密度值为纵坐标，绘制标准曲线。密度值为纵坐标，绘制标准曲线。密度值为纵坐标，绘制标准曲线。第9页，本讲稿共18页2 2、RNARNA样品的测定样品的测定样品的测定样品的测定取两份取两份取两份取两份2.0ml2.0ml样品液于试管中，再各加入样品液于试管中，再各加入样品液于试管中，再各加入样品液于试管中，再各加入2.0ml2.0ml地衣地衣地衣地衣酚试剂，沸水浴保温酚试剂，沸水浴保温酚试剂，沸水浴保温酚试剂，沸水浴保温25min25min(严格控制时间），水浴冷却严格控制时间），水浴冷却5 5分钟分钟（不要骤冷）（不要骤冷）（不要骤冷）（不要骤冷），然后在，然后在，然后在，然后在670nm670nm波长处测定光密度值。波长处测定光密度值。波长处测定光密度值。波长处测定光密度值。每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三次取平均每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三次取平均每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三次取平均每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三次取平均值。值。值。值。根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的根据测得的光密度值，从标准曲线上查得相应的RNARNA的的的的mgmg数，按下式计算待测样品的数，按下式计算待测样品的数，按下式计算待测样品的数，按下式计算待测样品的RNARNA的含量。的含量。的含量。的含量。标曲比例系数：标曲比例系数：标曲比例系数：标曲比例系数：16.516.5匀浆匀浆匀浆匀浆RNARNA含量含量含量含量=比例系数比例系数比例系数比例系数*待测液吸光度待测液吸光度待测液吸光度待测液吸光度/肝质量肝质量肝质量肝质量（mg/gmg/g）第10页，本讲稿共18页实验实验3 3 二苯胺法测量二苯胺法测量DNADNA含量含量实验目的实验目的实验目的实验目的学习和掌握二苯胺法测定学习和掌握二苯胺法测定学习和掌握二苯胺法测定学习和掌握二苯胺法测定DNADNA含量的原理和方法。含量的原理和方法。含量的原理和方法。含量的原理和方法。实验原理实验原理实验原理实验原理DNADNA分子中的分子中的分子中的分子中的22脱氧核糖在酸性条件中脱水生成脱氧核糖在酸性条件中脱水生成脱氧核糖在酸性条件中脱水生成脱氧核糖在酸性条件中脱水生成-羟基羟基羟基羟基-酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热反应生成酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热反应生成酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热反应生成酮基戊醛，后者与二苯胺试剂一起加热反应生成蓝色物质，在蓝色物质，在蓝色物质，在蓝色物质，在595nm595nm处有最大吸收。处有最大吸收。处有最大吸收。处有最大吸收。DNADNA在在在在40400g40400g范范范范围内，光密度与围内，光密度与围内，光密度与围内，光密度与DNADNA的浓度成正比。在反应液中加入少量的浓度成正比。在反应液中加入少量的浓度成正比。在反应液中加入少量的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。乙醛，可以提高反应灵敏度。乙醛，可以提高反应灵敏度。乙醛，可以提高反应灵敏度。第11页，本讲稿共18页仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂仪器与试剂11、仪器：可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管、仪器：可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管、仪器：可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管、仪器：可见分光光度计、恒温水浴锅、移液管22、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：（1 1）200200g/mLDNAg/mLDNA标准溶液：标准溶液：标准溶液：标准溶液：准确称取纯准确称取纯准确称取纯准确称取纯DNA10mgDNA10mg，以，以，以，以0.1mol/LNaOH0.1mol/LNaOH溶液溶解，转移至溶液溶解，转移至溶液溶解，转移至溶液溶解，转移至50ml50ml容量瓶中，容量瓶中，容量瓶中，容量瓶中，用用用用0.1mol0.1molLNaOHLNaOH溶液稀释至刻度。溶液稀释至刻度。溶液稀释至刻度。溶液稀释至刻度。（2 2）二苯胺试剂：二苯胺试剂：二苯胺试剂：二苯胺试剂：称取称取称取称取2g2g结晶二苯胺，溶于结晶二苯胺，溶于结晶二苯胺，溶于结晶二苯胺，溶于200mL200mL分析分析分析分析纯冰醋酸中，加纯冰醋酸中，加纯冰醋酸中，加纯冰醋酸中，加5.5ml5.5ml浓硫酸棕色瓶保存。临用前加入浓硫酸棕色瓶保存。临用前加入浓硫酸棕色瓶保存。临用前加入浓硫酸棕色瓶保存。临用前加入2mL1.6%2mL1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）所配得的溶液应为无色。使用）所配得的溶液应为无色。使用）所配得的溶液应为无色。使用）所配得的溶液应为无色。（3 3）样品待测液：样品待测液：样品待测液：样品待测液：用上述实验方法提取的用上述实验方法提取的用上述实验方法提取的用上述实验方法提取的DNADNA样品样品样品样品第12页，本讲稿共18页试试 管管0 01 12 23 34 45 5200200g/mLg/mL标准标准DNADNA溶液溶液/mL/mL0 00.40.40.80.81.21.21.61.62.02.0蒸馏水蒸馏水/mL/mL2.02.01.61.61.21.20.80.80.40.40 0二苯胺试剂二苯胺试剂/mL/mL4 44 44 44 44 44 4100100恒温水浴中保温恒温水浴中保温15min15min，(严格控制时间）冷却（水浴冷却冷却（水浴冷却5 5分钟后直接测量），在分钟后直接测量），在595nm595nm波长处比色波长处比色光密度值光密度值00.0810.1600.2310.3090.376实验操作实验操作实验操作实验操作1 1、DNADNA标准曲线的制作标准曲线的制作标准曲线的制作标准曲线的制作(空白调零）空白调零）空白调零）空白调零）此步省略此步省略此步省略此步省略取取取取6 6支试管，按下表操作。以支试管，按下表操作。以支试管，按下表操作。以支试管，按下表操作。以DNADNA浓度为横坐标，光浓度为横坐标，光浓度为横坐标，光浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。密度值为纵坐标，绘制标准曲线。密度值为纵坐标，绘制标准曲线。密度值为纵坐标，绘制标准曲线。第13页，本讲稿共18页2 2、DNADNA样品的测定样品的测定样品的测定样品的测定取两份待测样品各取两份待测样品各取两份待测样品各取两份待测样品各2mL2mL，各加入二苯胺溶液，各加入二苯胺溶液，各加入二苯胺溶液，各加入二苯胺溶液4mL4mL，摇，摇，摇，摇匀，匀，匀，匀，100100恒温水浴中保温恒温水浴中保温15min(15min(严格控制时间）严格控制时间），水水浴冷却浴冷却5 5分钟分钟（不要骤冷）（不要骤冷）（不要骤冷）（不要骤冷），然后在然后在然后在然后在595nm595nm波长处测定光波长处测定光波长处测定光波长处测定光密度值。密度值。密度值。密度值。每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三每次测量后拿出比色皿放入重新测量，每支测三次取平均值。次取平均值。次取平均值。次取平均值。根据测得的光密度值，从标准曲线上得到相根据测得的光密度值，从标准曲线上得到相根据测得的光密度值，从标准曲线上得到相根据测得的光密度值，从标准曲线上得到相应的应的应的应的DNADNA的的的的mgmg数，按下式计算待测样品的数，按下式计算待测样品的数，按下式计算待测样品的数，按下式计算待测样品的DNADNA的含量。的含量。的含量。的含量。标曲比例系数：标曲比例系数：标曲比例系数：标曲比例系数：13.2613.26匀浆匀浆匀浆匀浆DNADNA含量含量含量含量=比例系数比例系数比例系数比例系数*待测液吸光度待测液吸光度待测液吸光度待测液吸光度/肝质量肝质量肝质量肝质量（mg/gmg/g）第14页，本讲稿共18页注意事项注意事项11、戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖也对、戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖也对、戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖也对、戊糖或含戊糖的物质对本法有干扰；某些己糖也对本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生物，本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生物，本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生物，本法有干扰（糖经浓无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生物，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除方法为，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除方法为，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除方法为，在浓无机酸作用下，与苯酚生成缩合物）；去除方法为，低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲液中低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲液中低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲液中低浓度乙醇沉淀法和醋酸钾沉淀法，提高缓冲液中NaClNaCl浓浓浓浓度也可。度也可。度也可。度也可。22、样品中蛋白质含量高时、样品中蛋白质含量高时、样品中蛋白质含量高时、样品中蛋白质含量高时,应先用应先用应先用应先用5%5%三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液三氯乙酸溶液(TCA)(TCA)沉淀蛋白质后再测定。沉淀蛋白质后再测定。沉淀蛋白质后再测定。沉淀蛋白质后再测定。第15页，本讲稿共18页33、微量微量微量微量DNADNA无影响无影响无影响无影响,较多较多较多较多DNADNA存在时存在时存在时存在时,有干扰作用有干扰作用有干扰作用有干扰作用,如在试剂中加入适量如在试剂中加入适量如在试剂中加入适量如在试剂中加入适量CuClCuCl2 22H2H2 2OO可减少可减少可减少可减少DNADNA的干扰的干扰的干扰的干扰,甚至甚至甚至甚至某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反某些已糖在持续加热后生成的羟甲基糖醛也能与地衣酚反应应应应,产生显色复合物产生显色复合物产生显色复合物产生显色复合物.此外此外此外此外,利用利用利用利用RNARNA和和和和DNADNA显色复合物的显色复合物的显色复合物的显色复合物的最大吸收不同最大吸收不同最大吸收不同最大吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区分且在不同时间显示最大色度加以区分且在不同时间显示最大色度加以区分且在不同时间显示最大色度加以区分,反应反应反应反应2min2min后后后后,DNA,DNA在在在在600nm600nm显示最大吸收显示最大吸收显示最大吸收显示最大吸收,而而而而RNARNA在反应在反应在反应在反应15min15min后后后后,在在在在670nm670nm下呈现最大吸收下呈现最大吸收下呈现最大吸收下呈现最大吸收.44、地衣酚、地衣酚、地衣酚、地衣酚-三氯化铁试剂需临用时配制，由于试剂中三氯化铁试剂需临用时配制，由于试剂中三氯化铁试剂需临用时配制，由于试剂中三氯化铁试剂需临用时配制，由于试剂中有浓盐酸，反应时需加盖保鲜膜，防止盐酸挥发。有浓盐酸，反应时需加盖保鲜膜，防止盐酸挥发。有浓盐酸，反应时需加盖保鲜膜，防止盐酸挥发。有浓盐酸，反应时需加盖保鲜膜，防止盐酸挥发。第16页，本讲稿共18页溶液配制：溶液配制：溶液配制：溶液配制：柠檬酸钠缓冲溶液：柠檬酸钠缓冲溶液：氯化钠氯化钠 8.19g8.19g，柠檬酸钠，柠檬酸钠14.7g14.7g，EDTA 0.3gEDTA 0.3g（或（或0.38g0.38g含结晶水含结晶水EDTAEDTA），加蒸馏水定容至），加蒸馏水定容至1L1L 氯化钠用于调节盐浓度沉淀氯化钠用于调节盐浓度沉淀DNPDNP，分离，分离DNPDNP、RNPRNP，柠檬酸钠抗凝血，维持，柠檬酸钠抗凝血，维持PHPH，EDTAEDTA抑制核酸酶活抑制核酸酶活 20%SDS20%SDS:20g SDS 20g SDS 加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至100ml100ml SDS SDS为去污剂，蛋白质变性剂为去污剂，蛋白质变性剂,结合蛋白沉淀结合蛋白沉淀 10%NaCl10%NaCl：10g NaCl 10g NaCl加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至100ml100ml 此浓度氯化钠用于溶解此浓度氯化钠用于溶解DNPDNP氯仿氯仿-异戊醇异戊醇：氯仿：氯仿96ml96ml，异戊醇，异戊醇4ml4ml混合，混合，棕色瓶保存棕色瓶保存 氯仿用于变性分离蛋白，异戊醇可消除泡沫，助于分层氯仿用于变性分离蛋白，异戊醇可消除泡沫，助于分层 酚仿醇溶液酚仿醇溶液：苯酚：苯酚100ml100ml，氯仿，氯仿96ml96ml，异戊醇，异戊醇4ml4ml混合（混合（变性分离蛋白，异戊醇可消除泡沫，助于分层变性分离蛋白，异戊醇可消除泡沫，助于分层 0.1mol/L NaOH0.1mol/L NaOH溶液：溶液：4g NaOH 4g NaOH 加蒸馏水定容至加蒸馏水定容至1L1L 定容定容DNADNA的溶剂的溶剂 第17页，本讲稿共18页二苯胺试剂：二苯胺试剂：A液液使用前称取使用前称取使用前称取使用前称取2g2g结晶二苯胺，溶于结晶二苯胺，溶于结晶二苯胺，溶于结晶二苯胺，溶于200mL200mL分析纯冰醋酸中，加分析纯冰醋酸中，加分析纯冰醋酸中，加分析纯冰醋酸中，加5.5ml5.5ml浓硫酸棕色瓶保存。浓硫酸棕色瓶保存。浓硫酸棕色瓶保存。浓硫酸棕色瓶保存。B液液2mL1.6%2mL1.6%乙醛溶液（乙醛溶液应保存乙醛溶液（乙醛溶液应保存乙醛溶液（乙醛溶液应保存乙醛溶液（乙醛溶液应保存于冰箱，一周内可使用）临用前加入，可提前配制于冰箱，一周内可使用）临用前加入，可提前配制于冰箱，一周内可使用）临用前加入，可提前配制于冰箱，一周内可使用）临用前加入，可提前配制50ml50ml存存存存于冰箱于冰箱于冰箱于冰箱地衣酚试剂：地衣酚试剂：取取取取0.1gFeCl0.1gFeCl336H6H2 2OO溶于溶于溶于溶于100mL100mL浓浓浓浓HClHCl配制成配制成配制成配制成0.1%0.1%三氯化铁浓盐酸溶液，为地衣酚贮存液。使用前再用三氯化铁浓盐酸溶液，为地衣酚贮存液。使用前再用三氯化铁浓盐酸溶液，为地衣酚贮存液。使用前再用三氯化铁浓盐酸溶液，为地衣酚贮存液。使用前再用上述溶液为溶剂加入上述溶液为溶剂加入上述溶液为溶剂加入上述溶液为溶剂加入0.1g0.1g地衣酚配成地衣酚配成地衣酚配成地衣酚配成0.1%0.1%的地衣酚溶液。的地衣酚溶液。的地衣酚溶液。的地衣酚溶液。（临用时配制）（临用时配制）（临用时配制）（临用时配制）溶液配制：溶液配制：溶液配制：溶液配制：第18页，本讲稿共18页