浙江大学王镜岩生物化学甲上第09章核酸的生物合成.ppt

第九章第九章 核酸的生物合成核酸的生物合成中心法则中心法则l生物的遗传信息从生物的遗传信息从 DNADNA传递给传递给 mRNAmRNA的过程称为转录。根据的过程称为转录。根据 mRNAmRNA链上的遗传信息合成蛋链上的遗传信息合成蛋 白质的过程，被称为翻译和白质的过程，被称为翻译和 表达。表达。19581958年年CrickCrick将生物将生物 遗传信息的这种传递方式称为中心法则。遗传信息的这种传递方式称为中心法则。Reverse transcription第一节第一节 DNA的生物合成的生物合成一、一、DNADNA的半保留复制的半保留复制 复制时期复制时期 1.半保留复制的证明半保留复制的证明2.DNA2.DNA生物合成的基本问题生物合成的基本问题l 模板模板l 引物引物l dNTPdNTPl DNA DNA聚合酶聚合酶l MgMg2 2l在在5-35-3方向延伸方向延伸二、原核细胞二、原核细胞DNADNA的复制合成的复制合成 1.1.原核原核DNADNA聚合酶聚合酶2.2.复制的复杂性复制的复杂性 5533 酶作用DNA聚合酶53聚合酶及外切酶作用，35外切酶酶作用，可校正/修复DNA链，还可切除引物DNA聚合酶53聚合酶及35外切酶酶作用，可校正/修复DNA链DNA聚合酶与酶作用类似，酶活高，是主要的链延伸酶（聚合酶 replicase）l 冈崎片段与半不连续复制（冈崎片段与半不连续复制（okazakiokazaki 1968 1968年）年）l 复制方向：复制方向：单起点、双向或单向复制单起点、双向或单向复制l 引物（引物（primerprimer）及引物酶）及引物酶(primaseprimase)l 引物的切除与连接引物的切除与连接 5533外切酶外切酶 切除引物切除引物 （DNADNA聚合酶聚合酶）DNADNA连接酶连接酶 （大肠杆菌（大肠杆菌DNADNA连接酶连接酶/T/T4 4连接酶）连接酶）l 复制的起始复制的起始 辨识起点（富含辨识起点（富含ATAT区）区）解旋（拓扑异构酶）解旋（拓扑异构酶）解链解链 单链结合蛋白（单链结合蛋白（SSBSSB）三、真核三、真核DNADNA的复制合成的复制合成 真核真核真核真核DNADNADNADNA的合成的基本过程类似于原核的合成的基本过程类似于原核的合成的基本过程类似于原核的合成的基本过程类似于原核DNADNADNADNA，不同之处：不同之处：不同之处：不同之处：l l 多复制起点多复制起点多复制起点多复制起点l l 至少有五种聚合酶至少有五种聚合酶至少有五种聚合酶至少有五种聚合酶l l 端粒的复制依赖于端粒酶端粒的复制依赖于端粒酶端粒的复制依赖于端粒酶端粒的复制依赖于端粒酶真核生物真核生物DNA聚合酶聚合酶亚基数44425分子量（KD)25036-38160-300170256细胞内定位核核线粒体核核53聚合活性35外切活性功能复制、引发修复复制复制复制DNADNA复制过程复制过程真核生物真核生物DNADNA复制叉结构示意图复制叉结构示意图四、反转录作用（四、反转录作用（RNARNA指导下的指导下的DNADNA合成）合成）19701970年，年，TeminTemin和和BaltimoreBaltimore在致癌在致癌RNARNA病毒中发现病毒中发现了反转录酶（了反转录酶（Reverse TranscriptaseReverse Transcriptase）1.DNA1.DNA聚合酶特性聚合酶特性 需引物（需引物（tRNAtRNA）、）、dNTPdNTP、模板（、模板（RNARNA、DNADNA）、）、5-35-3方向聚方向聚合合 2.2.杂交分子杂交分子H H键断开键断开 常由核糖核苷酶常由核糖核苷酶H H（RNAaseRNAase H H）专一切除）专一切除RNA-DNARNA-DNA分子中的分子中的RNA,RNA,全部或部分去除全部或部分去除RNARNA 3.3.前病毒前病毒DNADNA 合成的合成的DNADNA链称负链链称负链,然后由依赖然后由依赖DNADNA的的DNADNA聚合酶催化下聚合酶催化下,以以负链为模板合成一正链这样形成的负链为模板合成一正链这样形成的DNADNA称前病毒称前病毒DNA,DNA,前病毒前病毒DNADNA可嵌入宿主细胞可嵌入宿主细胞DNADNA中中(称整合称整合)或潜伏于宿主细胞用其负或潜伏于宿主细胞用其负链链(依赖依赖DNADNA的的RNARNA聚合酶聚合酶)出出RNA,RNA,合成外壳蛋白合成外壳蛋白.1.1五、五、DNA的损伤与修复的损伤与修复1.DNA1.DNA1.DNA1.DNA的损伤与突变的损伤与突变的损伤与突变的损伤与突变 损伤可造成突变或致死损伤可造成突变或致死 突变（突变（mutation）：）：指一种遗传状态，可以通过复指一种遗传状态，可以通过复制而遗传的制而遗传的DNA结构的任何永久性改变。携带突变结构的任何永久性改变。携带突变基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。基因的生物称为突变体，未突变的称为野生型。l l损伤原因损伤原因损伤原因损伤原因物理（物理（物理（物理（紫外紫外紫外紫外（见下页）（见下页）（见下页）（见下页）、高能射线、电离辐射）、高能射线、电离辐射）、高能射线、电离辐射）、高能射线、电离辐射）化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）化学（烷基化试剂、亚硝酸盐、碱基类似物）生物因素（碱基对置换、碱基的插入生物因素（碱基对置换、碱基的插入生物因素（碱基对置换、碱基的插入生物因素（碱基对置换、碱基的插入/缺失造成移缺失造成移缺失造成移缺失造成移码）码）码）码）l当当DNADNA受到大剂量紫外线（波长受到大剂量紫外线（波长260nm260nm附近）照射附近）照射时，可引起时，可引起DNADNA链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚链上相邻的两个嘧啶碱基共价聚合，形成二聚体，例如合，形成二聚体，例如TTTT二聚体。二聚体。2.DNA损伤修复损伤修复l光复活光复活l切除修复切除修复l重组修复重组修复lSOS修复修复光复活（光复活（photoreactivation）l可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。l是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。切除修复（切除修复（excision repair）l即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤的部分切除掉，并以完整的那一段为模板，合成出切去的部分，从而使DNA恢复正常。这是一种比较普遍的修复机制。l细胞的修复功能对于保护遗传物质DNA不受破坏有重要意义。重组修复（重组修复（recombination repair）l又称复制后修复（postreplication repair）l受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。通过分子间重组，从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再用合成的多核苷酸来补上母链的空缺，此过程即重复修复。并非完全校正。SOSSOS修复修复l指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，又称倾错性修复（Error-Prone Repair）。3.3.基因重组与基因重组与DNADNA克隆（基因工程）克隆（基因工程）l l限制性内切酶限制性内切酶能识别能识别DNADNA特定核苷酸序列的核酸内切酶特定核苷酸序列的核酸内切酶分布：主要在微生物中。主要在微生物中。特点：特特异异性性，即即识识别别特特定定核核苷苷酸酸序序列列，切割特定切点。切割特定切点。结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。产生黏性未端（碱基互补配对）。举例：大大肠肠杆杆菌菌的的一一种种限限制制酶酶能能识识别别GAATTCGAATTC序列，并在序列，并在G G和和A A之间切开。之间切开。vv一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将定的切割点上将定的切割点上将定的切割点上将DNA DNA DNA DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有分子切断。目前已发现的限制酶有分子切断。目前已发现的限制酶有分子切断。目前已发现的限制酶有400400400400500500500500多种。多种。多种。多种。运载体种类运载体种类：质粒质粒质粒质粒、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。、噬菌体和动植物病毒。质粒的特点质粒的特点质粒的特点质粒的特点:l l细细细细胞胞胞胞染染染染色色色色体体体体外外外外能能能能自自自自主主主主复复复复 制制制制的的的的小小小小型型型型环环环环状状状状 DNADNADNADNA分子；分子；分子；分子；l l质粒是基因工程中最常用的运载体；质粒是基因工程中最常用的运载体；质粒是基因工程中最常用的运载体；质粒是基因工程中最常用的运载体；l l最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；最常用的质粒是大肠杆菌的质粒；l l存在于许多细菌及酵母菌等生物中；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；存在于许多细菌及酵母菌等生物中；l l质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的存在对宿主细胞无影响；质粒的存在对宿主细胞无影响；l l质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。质粒的复制只能在宿主细胞内完成。l l DNADNA重组与克隆重组与克隆从细胞中分从细胞中分从细胞中分从细胞中分离出离出离出离出DNADNADNADNA限制酶截取限制酶截取限制酶截取限制酶截取DNADNADNADNA片断片断片断片断分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆分离大肠杆菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒菌中的质粒 DNA DNA DNA DNA重组重组重组重组用重组质粒用重组质粒用重组质粒用重组质粒转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌转化大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因克隆大量基因重组体的筛选重组体的筛选重组体的筛选重组体的筛选PCR(polymerasePCR(polymerase Chain Chain reaction)reaction)聚合酶链式反应聚合酶链式反应PCRPCR也称体外酶促基因扩增，原理类似天然也称体外酶促基因扩增，原理类似天然DNADNA复制。靶复制。靶DNADNA分子变性后解链，两条单链分子变性后解链，两条单链DNADNA分别与两条引物互补分别与两条引物互补结合，在结合，在4 4种种dNTPdNTP存在和合适和条件下，由耐热的存在和合适和条件下，由耐热的TaqTaq DNADNA聚合酶催化引物由聚合酶催化引物由5 5 3 3 扩增延伸，形成两条新扩增延伸，形成两条新的双链的双链DNADNA分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变分子，并作为下一循环的模板。每经过一个变性、复性、延伸循环，模板性、复性、延伸循环，模板DNADNA增加一倍。经过增加一倍。经过30305050个个循环，可使原循环，可使原DNADNA量增加量增加106106109109倍。倍。PCRPCRPCRPCR的主要步骤：的主要步骤：的主要步骤：的主要步骤：模板DNA的变性 一般选用95左右1min，使DNA 双链解为单链 复性 按引物实际情况确定适当温度，时间一般30s至1.5min 延伸 一般72 1min 循环数 按初始模板浓度确定，一般2545之间PCRPCR的引物设计的引物设计PCR扩增产物的特异性主要由引物决定，引物的设计是PCR成功的关键，引物位置和产物长度 根据不同目的和要求确定，长度一般在200800bp之间 引物的长度 一般为1825bp 末端核苷酸 3端不得有任何修饰 GC含量和Tm值 一般在4060%之间，两条相差23 第二节第二节 RNARNA的生物合成的生物合成DNADNA携带的遗传信息（基因）携带的遗传信息（基因）传递给传递给RNARNA分子的过程称转分子的过程称转录（录（transcription）。）。在生物界，在生物界，RNARNA合成有两种方式：一合成有两种方式：一是是DNADNA指导的指导的RNARNA合成，此为生物体内合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是的主要合成方式。另一种是RNARNA指导的指导的RNARNA合成，此种方式常见于病毒。转录合成，此种方式常见于病毒。转录产生的初级转录本是产生的初级转录本是RNARNA前体（前体（RNA RNA precursorprecursor），需经加工过程），需经加工过程（processingprocessing）方具有生物学活性。）方具有生物学活性。反应体系：反应体系：DNA模板,NTP,酶，Mg2+,Mn2+，合成方向 53。连接方式-3,5磷酸二酯键。转录特点：转录特点：不对称转录-DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板，这种转录方式称作不对称转录不对称转录。模板链模板链(template strand)及反意义链及反意义链(antisense strand):指导RNA合成的DNA链为模板链，又称反意义链。编码链编码链(coding strand)及有意义链及有意义链(sense strand)：不作为转录的另一条DNA链为编码链，又称有意义链。由于基因分布于不同的DNA单链中，即某条DNA单链对某个基因是模板链，而对另一个基因则是编码链。原料：原料：四种磷酸核苷NTP,DNA中的T在RNA合成中变为U 合成过程合成过程:连续，方向：方向：53从头合成,5末端的起始核苷酸常为GTP或ATP一、转录基本特点一、转录基本特点l不对称转录l“转录单位”（transcription unit）以操纵子（operon）为转录的功能单位,结构上包括四个功能区：多顺反子（结构基因区）、启动子、操作子、终止子和调节基因。l原核RNA聚合酶l转录过程二、原核细胞二、原核细胞RNARNA转录合成特点转录合成特点调节基因调节基因启动子启动子操纵操纵基因基因lacZ lacYlacACAPcAMPCAP-CAP-cAMPcAMP复合物复合物mRNAmRNA+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透过酶-半乳糖苷乙酰基转移酶酶forwardforward 大肠杆菌的大肠杆菌的RNARNA聚合酶聚合酶 全酶由全酶由5 5种亚基种亚基2 2 组成组成，因子与其它因子与其它部分的结合不是十分紧密，它易于与部分的结合不是十分紧密，它易于与2 2分离，分离，没有没有、亚基的酶称为核心酶亚基的酶称为核心酶只催化链的延长，只催化链的延长，对起始无作用。对起始无作用。五种亚基的功能分别为：五种亚基的功能分别为：亚基：亚基：与启动子结合功能。与启动子结合功能。亚基亚基：含催化部位，起催化作用，催化形：含催化部位，起催化作用，催化形 成磷酸二成磷酸二酯键。酯键。亚基：在全酶中存在，功能不清楚。亚基：在全酶中存在，功能不清楚。亚基亚基：与：与DNADNA模板结合功能。模板结合功能。亚基：亚基：识别起始位点。识别起始位点。识别识别解链解链起始起始延伸延伸终止终止 1.1.起始位点的识别起始位点的识别 识别正确的启动位点，识别正确的启动位点，启动子的结构至少由三部分组启动子的结构至少由三部分组成：成：-35-35序列提供了序列提供了RNARNA聚合酶全酶识别的信号；聚合酶全酶识别的信号；-10-10序列是序列是酶的紧密结合位点（富含酶的紧密结合位点（富含ATAT碱基，利于双链打开）；第三碱基，利于双链打开）；第三部分是部分是RNARNA合成的起始点。合成的起始点。35+1转录起始点转录起始点AACTGTATATTATTGACATATAAT5335序列序列 Sextama 框框10序列序列Pribnow框框2.2.2.2.转录起始转录起始转录起始转录起始 加入的第一个核苷三磷酸常是加入的第一个核苷三磷酸常是GTPGTP或或ATPATP。所形成的所形成的启动子、全酶和启动子、全酶和核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物核苷三磷酸复合物称为三元起始复合物，第一个核苷三磷酸一旦掺入，第一个核苷三磷酸一旦掺入到转录起始点，到转录起始点，亚基就会被释放脱离核心酶。亚基就会被释放脱离核心酶。-35-10pppG或pppA55553333模板链模板链E 3.3.链的延伸链的延伸 以NTP为原料和能量,DNA模板链为模板，靠核心酶的催化，核苷酸间通过3,5-磷酸二酯键成核糖核酸链(RNA)4.4.转录终止转录终止 转转录终止信号有两种情况录终止信号有两种情况 弱终止子：弱终止子：依赖依赖因子（终止因子，因子（终止因子，terminators）的终止的终止 NusANusA蛋白识别蛋白识别DNADNA链上的终止信号，在链上的终止信号，在因子帮助终止。因子帮助终止。强终止子：强终止子：（1 1）在终止点之前具有一段富含）在终止点之前具有一段富含G-CG-C的回文的回文区域。（区域。（2 2）富含）富含G-CG-C的区域之后是一连串的的区域之后是一连串的dAdA碱基序列，碱基序列，它们转录的它们转录的RNARNA链的末端为一连串链的末端为一连串U U（连续连续6 6个）个）。三、真核生物的转录作用三、真核生物的转录作用酶类分布产物活性分子量(KDa)反应条件核仁核质核质rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA5070204010500700700低离子强度要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度1.1.真核真核RNARNA聚合酶聚合酶2.2.转录转录 真核真核RNARNA转录基本过程与原核类似，但其产生的转录基本过程与原核类似，但其产生的mRNAmRNA为为“单顺反子单顺反子”，只编码一条肽链。，只编码一条肽链。四、转录过程的选择性抑制剂四、转录过程的选择性抑制剂 放线菌素放线菌素D D利福平利福平鹅膏蕈碱鹅膏蕈碱原核原核抑制抑制抑制抑制不抑制不抑制真核真核抑制抑制不抑制不抑制抑制抑制RNARNA聚合酶聚合酶五、转录产物的五、转录产物的“加工加工”（成熟过程）（成熟过程）在细胞内，由在细胞内，由RNARNA聚合酶合成的原初转录物（聚合酶合成的原初转录物（primary primary transcripttranscript）往往需要一系列的变化，包括链的裂解、往往需要一系列的变化，包括链的裂解、5 5 和和3 3 末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以末端的切除和特殊结构的形成、核苷的修饰、以及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的及拼接和编辑等过程，才转变为成熟的RNARNA分子。此过程分子。此过程总称为总称为RNARNA的成熟的成熟或称为或称为RNARNA的转录后加工。的转录后加工。原核生物原核生物的的mRNAmRNA转录后一般不需要加工，转录的同时转录后一般不需要加工，转录的同时即进行翻译（半寿期短）。即进行翻译（半寿期短）。rRNA前体的转录后加工前体的转录后加工tRNA前体的加工前体的加工真核真核mRNA前体的加工前体的加工 lrRNArRNA前体的加工前体的加工lr rRNA基因之间以纵向串联的方式重复排列。l加工过程：加工过程：1、剪切作用：需核酸酶参与。2、甲基化修饰：修饰在碱基上。3、自我剪接：一种核酶的作用。原核原核rRNArRNA加工：加工：rRNA含非转录的间隔区，其产物中含tRNA 真核真核rRNArRNA加工：加工：1.5S自成体系加工少无修饰和剪接。2.45S加工中含剪切和甲基化修饰，需核酸酶。大肠杆菌rRNA前体加工真核生物rRNA前体加工ltRNAtRNA前体的加工前体的加工ltRNAtRNA前体在前体在tRNAtRNA剪切酶的作用下，切成一定数量的剪切酶的作用下，切成一定数量的tRNAtRNA分子分子 l33末端加上末端加上CCACCAl碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用碱基的修饰：甲基化、脱氨和还原作用l 真核真核mRNAmRNA前体的加工前体的加工l剪接剪接（SplicingSplicing）去除内含子，连接外显子l55帽端结构的生成（如图）帽端结构的生成（如图）l33端多聚端多聚A A（polyApolyA）的附加）的附加六、六、RNARNA的复制合成（的复制合成（RNARNA指导的指导的RNARNA合成）合成）v噬菌体噬菌体QQ的的RNARNA复制两阶段复制两阶段（1 1）其单链其单链RNARNA可充当可充当mRNAmRNA，利用寄主中的核糖体合成利用寄主中的核糖体合成外壳蛋外壳蛋白白和和RNARNA复制酶的复制酶的亚基。亚基。（2 2）复制酶的复制酶的亚基可与来自寄主细胞的亚基亚基可与来自寄主细胞的亚基 自动装自动装配成配成RNARNA复制酶复制酶，可进行，可进行RNARNA的复制，以分子中单链的复制，以分子中单链RNARNA为模为模板（正链），复制出一条新的板（正链），复制出一条新的RNARNA链（负链），再复制出链（负链），再复制出正正链链，与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。，与外壳蛋白组装成新的噬菌体颗粒。v某些某些RNARNA病毒可以以自身病毒可以以自身RNARNA为为模板进行复制。模板进行复制。v不同的不同的RNARNA病毒复制方式不同病毒复制方式不同5RNA-533RNA+释放释放释放释放353355RNA+RNA+RNA-vRNA-及及 RNA+的合成方向均为的合成方向均为5 3核酶核酶 l1982年Cech发现四膜虫rRNA前体自我剪接作用，RNA有催化作用;1983年发现RNase P中的RNA可催化tRNA前体的加工。l核酶自我切割区内有锤头结构核酶自我切割区内有锤头结构（hammer-headstructure），其中的结构特点是：（1）三个茎区形成局部的双链结构；其中含13个保守的核苷酸，N代表任何核苷酸。（2）图中的箭头表示自我切割位点，位于GUX的X外侧，X可表示为C、U或A，不能是G。l核酶的生物学意义核酶的生物学意义 1.RNA为生物催化剂，具有重要生物学意义。2.打破了酶是蛋白质的传统观念。3.在生命起源问题上，为先有核酸提供了依据。4.为治疗破坏有害基因，肿瘤等疾病提供手段。七、基因表达转录调控方式七、基因表达转录调控方式l基因表达调控概述基因表达调控概述l原核生物以操纵子为单元进行表达和调控，特异原核生物以操纵子为单元进行表达和调控，特异的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要因素。的阻遏蛋白是控制原核启动序列活性的重要因素。l 乳糖操纵子的调节机制乳糖操纵子的调节机制l色氨酸操纵子的调节机制色氨酸操纵子的调节机制I I调节基因调节基因P P启动子启动子O O操作子（操操作子（操作基因）作基因）Z Z、Y Y、A A三种三种结构基因结构基因l阻遏蛋白的负性调节阻遏蛋白的负性调节当无诱导物乳糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白当无诱导物乳糖存在时，调节基因编码的阻遏蛋白（repressor proteinrepressor protein）处于活性状态，阻止）处于活性状态，阻止RNARNA聚合酶与启聚合酶与启动基因的结合，则无法启动转录。动基因的结合，则无法启动转录。当有乳糖存在时，当有乳糖存在时，laclac操纵子（元）即可被诱导。乳糖进操纵子（元）即可被诱导。乳糖进入细胞，经入细胞，经半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与蛋白与O O序列解离、转录发生。序列解离、转录发生。异丙基硫代半乳糖苷（异丙基硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）是一种作用极强的诱导）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。l CAPCAP（代谢产物活化蛋白）的（代谢产物活化蛋白）的正性调节正性调节 当没有葡萄糖及当没有葡萄糖及cAMPcAMP浓度较高时，浓度较高时，cAMPcAMP与与CAPCAP结合，这时结合，这时CAPCAP结合在结合在laclac启动序列附近的启动序列附近的CAPCAP位点，可刺激位点，可刺激RNARNA转录活性转录活性。葡萄糖的分解代谢产物能抑制腺苷酸环化酶活性并活化磷。葡萄糖的分解代谢产物能抑制腺苷酸环化酶活性并活化磷酸二酯酶，从而降低了酸二酯酶，从而降低了cAMPcAMP的浓度，的浓度，CAPCAP不能被活化形成不能被活化形成CAPCAPcAMPcAMP复合物，则不能转录。复合物，则不能转录。llaclac阻遏蛋白负性调节与阻遏蛋白负性调节与CAPCAP正性调节两种机制协调合作：正性调节两种机制协调合作：当当LacLac阻遏蛋白封闭转录时，阻遏蛋白封闭转录时，CAPCAP对该系统不能发挥作用；对该系统不能发挥作用；但是如果没有但是如果没有CAPCAP存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白存在来加强转录活性，即使阻遏蛋白从操纵序列上解聚仍几无转录活性。从操纵序列上解聚仍几无转录活性。l laclac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需缺乏葡萄操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需缺乏葡萄糖。糖。调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因mRNAmRNA酶蛋白酶蛋白调节基因调节基因操纵基因操纵基因结构基因结构基因辅阻遏物辅阻遏物trp阻遏蛋白原阻遏蛋白原l调节基因编码的阻遏蛋白原不与操作基因结合，结构基因转调节基因编码的阻遏蛋白原不与操作基因结合，结构基因转录。录。Trp或或TrpRNA与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与与阻遏蛋白结合，使之构象发生变化与操纵基因结合，结构基因不能表达。操纵基因结合，结构基因不能表达。阻遏物调节机制阻遏物调节机制衰减子调节机制衰减子调节机制衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，衰减子：在转录水平上调节基因表达的衰减作用，用于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰减用于终止和减弱转录，这种调节的作用部位叫衰减子子是一种位于结构基因上游前导区的终止子。是一种位于结构基因上游前导区的终止子。真核基因的调控真核基因的调控翻译调节（translationalcontrol）真核染色质体（DNA）转录前调节转录初级产物RNA（ProRNA）hnRNA转录后加工的调节（RNAProcessingcontrol）转运调节（RNAtransportcontrol）mRNAmRNA降解的调控mRNA降解物多肽链翻译后加工及蛋白质活性控制（proteinactivitycontrol）活性蛋白失活蛋白转录调节（transcriptioncontrol）l l顺式作用元件顺式作用元件顺式作用元件顺式作用元件(ciscisciscisactingactingactingacting elements)elements)elements)elements)真核基因的顺式调控元件是基因周围能与特异转录因子结合而影响转录的DNA序列。其中主要是起正性调控作用的顺式作用元件，包括启动子(promoter)、增强子(enhancer)；近年又发现起负性调控作用的元件沉寂子(silencer)。l l1.1.1.1.启动子（启动子（启动子（启动子（PromoterPromoterPromoterPromoter）是指是指RNARNA聚合酶结合并起动转录的聚合酶结合并起动转录的DNADNA序列。真核序列。真核启动子一般包括转录起始点及其上游约启动子一般包括转录起始点及其上游约100100200bp200bp序列，包含有若干具有独立功能的序列，包含有若干具有独立功能的DNADNA序列元件，每个元件约长序列元件，每个元件约长7 730bp30bp。l启动子中的元件可以分为两种：l核心启动子元件(core promoter element)指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游25/30bp处的TATA盒。核心元件单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录。l上游启动子元件(upstream promoter element)包括通常位于70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件l l2.2.2.2.增强子（增强子（增强子（增强子（EhancerEhancerEhancerEhancer）一种能够提高转录效率的顺式调控元件，通常占一种能够提高转录效率的顺式调控元件，通常占100100200bp200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8 812bp12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点：，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。增强子的作用有以下特点：l增强子提高同一条增强子提高同一条DNADNA链上基因转录效率，链上基因转录效率，可以远距离作用可以远距离作用，通常可距，通常可距离离1 14kb4kb、个别情况下离开所调控的基因、个别情况下离开所调控的基因30kb30kb仍能发挥作用，而且在基因的上游仍能发挥作用，而且在基因的上游或下游都能起作用或下游都能起作用。l增强子作用与其序列的正反方向无关增强子作用与其序列的正反方向无关，将增强子方向倒置依然能起作用。，将增强子方向倒置依然能起作用。而将启动子倒就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。而将启动子倒就不能起作用，可见增强子与启动子是很不相同的。l增强子要有启动子才能发挥作用增强子要有启动子才能发挥作用，没有启动子存在，增强子不能表现活性。，没有启动子存在，增强子不能表现活性。l l3.3.3.3.沉寂子（沉寂子（沉寂子（沉寂子（silencersilencersilencersilencer）最早在酵母中发现，以后在最早在酵母中发现，以后在T T淋巴细胞的淋巴细胞的T T抗原受体基因的转录和重排中证实这种沉寂子的作用可不受序列方向的影响，也抗原受体基因的转录和重排中证实这种沉寂子的作用可不受序列方向的影响，也能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用，是一种负调控顺式元件。能远距离发挥作用，并可对异源基因的表达起作用，是一种负调控顺式元件。l lUASUASUASUAS（upstream upstream upstream upstream acticityacticityacticityacticity sequence sequence sequence sequence）CAATboxCAATbox（70708080）GC BOXGC BOX（8080110110）l l反式作用因子反式作用因子反式作用因子反式作用因子(transtranstranstransactingactingactingacting factors)factors)factors)factors)以反式作用影响转录的因子可统称为转录因子(transcription factors,TF)。RNA聚合酶是一种反式作用于转录的蛋白因子。l lGTFGTFGTFGTF（GenaralGenaralGenaralGenaral Transcription Factor Transcription Factor Transcription Factor Transcription Factor）lTBP(TATAbox binding protein)是唯一能识别TATA盒并与其结合的转录因子，是三种RNA聚合酶转录时都需要的；l不同基因由不同的上游启动子元件组成，能与不同的转录因子结合，这些转录因子通过与基础的转录复合体作用而影响转录的效率。现在已经发现有许多不同的转录因子，看到的现象是：同一DNA序列可被不同的蛋白因子所识别；能直接结合DNA序列的蛋白因子是少数，但不同的蛋白因子间可以相互作用，因而多数转录因子是通过蛋白质蛋白质间作用与DNA序列联系并影响转录效率的 蛋白质的锌指结构蛋白质的锌指结构蛋白质的锌指结构蛋白质的锌指结构转录调控的实质在于蛋白质与转录调控的实质在于蛋白质与转录调控的实质在于蛋白质与转录调控的实质在于蛋白质与DNADNADNADNA、蛋白质与蛋、蛋白质与蛋、蛋白质与蛋、蛋白质与蛋白质之间的相互作用白质之间的相互作用白质之间的相互作用白质之间的相互作用碱性亮氨酸拉链结构碱性亮氨酸拉链结构碱性亮氨酸拉链结构碱性亮氨酸拉链结构及其与及其与及其与及其与DNADNADNADNA的结合的结合的结合的结合