抗体检测技术与类风湿因子优秀课件.ppt
抗体检测技术与类风湿因子第1 页，本讲稿共32 页抗体检测技术免疫酶技术免疫酶技术免疫荧光技术免疫荧光技术凝集反应凝集反应沉淀反应沉淀反应补体结合试验补体结合试验放射免疫测定放射免疫测定蛋白印迹蛋白印迹免疫共沉淀免疫共沉淀亲和力测定亲和力测定 第2 页，本讲稿共32 页凝集反应l 凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。第3 页，本讲稿共32 页沉淀反应1、絮状沉淀反应2、环状沉淀反应3、双向扩散4、单向免疫扩散第4 页，本讲稿共32 页l 双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体，外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和定性抗原。第5 页，本讲稿共32 页抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉淀弧的特征不同：抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧有多条，彼此互不干扰。第6 页，本讲稿共32 页 酶联免疫吸附测定实验(ELISA)Enzyme linked immunosorbent assay 第7 页，本讲稿共32 页实验原理 ELISA ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性检测抗原或抗体敏感性检测抗原或抗体1.1.使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性疫活性2.2.使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性3.3.按一定步骤进行抗原抗体反应按一定步骤进行抗原抗体反应4.4.加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析第8 页，本讲稿共32 页方法类型ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试剂来源、标本性状以及检测的具体条件，可设计出不同类型的检测方法：1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法第9 页，本讲稿共32 页第10 页，本讲稿共32 页第11 页，本讲稿共32 页第12 页，本讲稿共32 页l A sandwich ELISA.(1)Plateiscoatedwithacaptureantibody;(2)sampleisadded,andanyantigenpresentbindstocaptureantibody;(3)detectingantibodyisadded,andbindstoantigen;(4)enzyme-linkedsecondaryantibodyisadded,andbindstodetectingantibody;(5)substrateisadded,andisconvertedbyenzymetodetectableform.第13 页，本讲稿共32 页一、试剂及仪器准备（一）免疫吸附剂1.固相载体 要求：吸附力强 能保持Ag或Ab活性 不参与化学反应 第14 页，本讲稿共32 页 载体性能比较 要求：载体材料 载体材料+、-结果差别大结果差别大 检测方法：10ug/L IgG10ug/L IgG包被 包被,加酶标抗加酶标抗IgGIgG，显色，显色后，测后，测2020孔的 孔的OD OD，要求，要求CV10%CV10%常用载体：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 等 形状：小试管、小珠、微量反应板小试管、小珠、微量反应板第15 页，本讲稿共32 页2.Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高3.免疫吸附剂(固相Ag或Ab)：l 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液l 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特异吸附的干扰第16 页，本讲稿共32 页 酶结合物：1.要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来 纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定 源丰富、标记后稳定2.常用酶：HRP、AP、-半乳糖苷酶等 3.底物：l HRP可溶性底物及呈色：邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm)5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2：荧光l HRP不可溶性底物及呈色：DAB：棕黄色-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘酚：灰蓝色l AP可溶性底物及呈色：对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)：荧光l AP不可溶性底物及呈色：NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色l-半乳糖苷酶：4-甲基伞基-半乳糖苷：荧光第17 页，本讲稿共32 页4.酶结合物的制备：l 戊二醛交联法l 过碘酸盐氧化法第18 页，本讲稿共32 页（三）设备：（三）设备：酶标比色仪简称酶标仪 ll指测读指测读ELISAELISA光度计；针对固相载体形式的不同，各有光度计；针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计特制的适用于板、珠和小试管的设计l l 性能指标 性能指标：测读速度、读数的准确性、重复性、精：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性确度和可测范围、线性ll 优良的酶标仪的读数一般可精确优良的酶标仪的读数一般可精确0.001 0.001，准确性为，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%l l 操作 操作：室温宜在：室温宜在15-30 15-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器15-30min15-30min，测读结果更稳定。测读测读结果更稳定。测读AA值时，要选用产物的敏感吸值时，要选用产物的敏感吸收峰，如收峰，如OPDOPD用 用492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测波长。有的酶标仪可用双波长式测读读第19 页，本讲稿共32 页第20 页，本讲稿共32 页用途l DrDennisEBidwellandAlisterVollercreatedtheELISAtesttodetectvariouskindofdiseases,suchasmalaria,Chagasdisease,andJohnesdisease.ELISAtestsalsoareusedasininvitrodiagnosticsinmedicallaboratories.TheotherusesofELISAinclude:l detectionofMycobacteriumantibodiesintuberculosisl detectionofrotavirusinfecesl detectionofhepatitisBmarkersinseruml detectionofenterotoxinofE.coliinfeces第21 页，本讲稿共32 页WESTERNBLOTl 步骤：l 试剂准备：l 1、SDS-PAGE 试剂:见电泳实验。l 2、匀浆缓冲液：1.0MTris-HCl(pH6.8)1.Oml；10%SDS6.0ml；-巯基乙醇0.2ml；ddH2O2.8ml。l 3、转膜缓冲液：甘氨酸2.9g；Tris5.8g；SDS0.37g；甲醇200ml；加ddH2O 定容至1000ml。l 4、0.01MPBS(pH7.4)：NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24g；加ddH2O 至1000ml。l 5、膜染色液：考马斯亮兰0.2g；甲醇80ml；乙酸2ml；ddH2O118ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0g 溶于20ml 的0.01MPBS 中。l 6、显色液：DAB6.0mg；0.01MPBS10.0ml；硫酸镍胺0.1ml；H2021.0l。第22 页，本讲稿共32 页l 样品制备l 含量测定第23 页，本讲稿共32 页lSDS PAGE 电泳第24 页，本讲稿共32 页l 转膜第25 页，本讲稿共32 页l 免疫反应第26 页，本讲稿共32 页l 化学发光第27 页，本讲稿共32 页类风湿因子l 类风湿因子（rheumatoidfactor,RF）可分为IgM、IgA、IgG、IgD、IgE 五型（注：在临床内科学中描述为四型，没有IgD 型；但在实验室诊断学中描述为5 型），是类风湿关节炎血清中针对IgGFC 片段上抗原表位的一类自身抗体，类风湿因子阳性患者较多伴有关节外表现，如皮下结节及血管炎等。第28 页，本讲稿共32 页类风湿因子l 约90%类风湿性关节炎（RA）患者的RF 呈阳性。lIgA-RF 与骨质破坏有关，早期IgA-RF 升高常提示病情严重，预后不良；IgE-RF 升高时，已属病情晚期。l 某些自身免疫病，如冷球蛋白血症、进行性全身性硬化症、干燥综合征、SLE 等患者都有较高的阳性率；一些其他疾病如血管炎、肝病、慢性感染也可出现RF。第29 页，本讲稿共32 页类风湿因子l 近年来对IgM 型类风湿因子的生物作用已有所了解，这些生物作用包括：l1、调节体内免疫反应；l2、激活补体，加快清除微生物感染；l3、清除免疫复合物使机体免受循环复合物的损伤。第30 页，本讲稿共32 页类风湿因子l 测定IgG、IgA、IgM 类RF 通常用ELISA 间接法，即用热凝集兔IgG 包被反应板微孔，加入检样后，再分别加抗人IgG、IgA、IgM 酶标记抗体，使反应后再与底物呈色。为防止各Ig 类别RF 相互干扰，酶标记抗体使用标记的抗体F（ab）2 片段。第31 页，本讲稿共32 页类风湿因子lRF 因子浓度的检测对自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征、结缔组织病、硬皮病等的诊断治疗和预后有重要的指导意义。另外，在慢性炎性反应性疾病中，因炎性反应对免疫系统造成的长期反复的刺激，引起免疫系统紊乱，也可导致RF 浓度的升高，如慢性活动性肝炎患者等。第32 页，本讲稿共32 页
