产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样与标本wnn.pptx

产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院产前诊断中绒毛、脐血、羊水取样及标本培养南京大学附属鼓楼医院妇产科南京大学附属鼓楼医院妇产科产前诊断中心产前诊断中心李李 洁洁 副主任医生副主任医生20062006年年1111月月产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院产前诊断指征n n夫妇任一方有染色体异常；n n曾生育过染色体病患者；n n夫妇任一方为单基因病患者；n n曾生育过单基因病患者；n n有不明原因的自然流产史、畸胎史、死产或新生儿死亡史；产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院产前诊断指征n n羊水过多的孕妇；n n夫妇任一方曾接触致畸因素；n n孕妇年龄大于35岁；n n有遗传病家族史的近亲婚配的夫妇。n n产前筛查高风险的孕妇n n超声胎儿结构筛查胎儿有结构异常的孕妇产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院产前诊断的方法n n羊膜腔穿刺取样（amniocentesis）n n绒毛穿刺取样（chorion villus sampling,cvs）n n脐带血取样（periumbilical cord blood sampling,PUBS）n n植入前诊断（preimplantaton genetic diagnosis,PGD）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院产前诊断的方法n n胎儿组织取样（皮肤、肝脏）n n胎儿镜（fetoscope）n n胚胎镜（embryoscope）n n胎儿超声波图象（fetal ultrasound imaging）n n母体外周血胎儿细胞检测（cell-storing）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛穿刺取样历史n n1975年 我国鞍山钢铁公司铁东医院首次问世（经宫颈盲吸法，准确率95%，自然流产率9.3%，出生婴儿未发现异常）n n莫斯科产科研究所（超声引导下经宫颈吸样）n n1983您 Ward 和 Brambati 分别于英国和意大利发表文章介绍绒毛取样及核型分析产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛穿刺取样时间n妊娠911周产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛穿刺取样抽取量n20mg左右（染色体核型分析约需10mg，DNA分析约需5mg，生化测定约需5-10mg）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛穿刺取样并发症n胎儿丢失n胎儿肢体发育缺陷（LRD）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院CVS并发症胎儿丢失n nCVS的流产率不比amniocentesis高n n经宫颈和经腹取样安全性相同（Jackson,1992）n n多胎取样高于单胎取样（Pergament,1992）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院CVS并发症LRDn n1999年WHO发布CVS综合性资料认为CVS与LRD无关（216，381例CVS中115例出现LRD发生率1：1881，总的人群发生率1：1642）n n世界各地相关资料综合，9周以下CVS出现LRD的机会高，但原因尚不清楚n nCVS不应在小于孕10周的条件下进行产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛穿刺取样方法n经宫颈（transcervical）n经腹（transabdorminal）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院CVS方法经宫颈取样n nB B超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实超采用高分辨的扇扫式或凸阵式实时超声诊断仪，经腹探头频率时超声诊断仪，经腹探头频率3.5MHz,3.5MHz,经阴道探头频率经阴道探头频率5-7MHz5-7MHz。n n采用特制较细的滋养层活检导管采用特制较细的滋养层活检导管（多聚乙烯导管），其塑料导管外（多聚乙烯导管），其塑料导管外径径1.4 1.6 mm,1.4 1.6 mm,长长20cm,20cm,带有导管芯带有导管芯，导管前端稍弯，外形似宫腔探子。，导管前端稍弯，外形似宫腔探子。n n导管另一端连接导管另一端连接10-20ml10-20ml含有含有2-4ml2-4ml生理盐水的注射器生理盐水的注射器产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院CVS方法经腹取样n n双针活检系统由双针活检系统由1 1根长根长1515cmcm、外径外径1.21.2mmmm的的1818号引导套针，及号引导套针，及1 1根长根长2020cmcm、外径外径0.80.8mmmm的的2222号活检针组成。号活检针组成。n n在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子在超声引导下，先将引导套针经腹壁及子宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯，宫穿刺入胎盘绒毛边缘部分，拔出针芯，然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛然后将活检针经引导套针内送入胎盘绒毛组织组织,连接含连接含2-42-4mlml生理盐水的生理盐水的2020mlml注射器，注射器，以以5 5mlml的负压上下移动活检针吸取绒毛组的负压上下移动活检针吸取绒毛组织织产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院CVS注意事项n n动作要轻柔n n穿刺部位在胎盘绒毛叶n n抽吸次数不宜过多产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊膜腔穿刺历史n n1956年 Fucks进行羊膜腔穿刺行胎儿性别鉴定及胎儿Rh溶血诊断n n1966年 Mark steele和Roy Breg从羊水中分离出羊水细胞培养成功并行胎儿核型分析产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊膜腔穿刺时间n1620周产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊膜腔穿刺抽取量n2030ml产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院抽取的羊水用途n n核型分析诊断染色体病n nDNA分析诊断单基因病n n生化测定诊断NTD、代谢性疾病产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊水穿刺n n穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部穿刺前孕妇俯卧位摇动腹部n n超声波定位引超声波定位引 导导n n采用采用2222号或号或2121号带芯长腰穿刺针头号带芯长腰穿刺针头n n垂直、快速进针垂直、快速进针n n抽取羊水抽取羊水2ml2ml弃置，换空针抽取羊水弃置，换空针抽取羊水产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊膜腔穿刺并发症n n胎儿丢失n n羊膜腔感染n n羊水渗漏n n穿刺部位的出血、血肿产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊穿并发症-胎儿丢失n n1976年，Nihd Registry 报道流产率3.5%n n1986年，Tabor et al 报道流产率1.7%n n1995年，Bombard et al 报道流产率1.3%n n2000年,Antsaklis 报道流产率2.1%产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐带血穿刺历史n n1972年，Valenti用儿科膀胱镜在中期妊娠孕妇行子宫切开术插入羊膜腔，获取脐血标本。n n1979年，Rodeck和Campell应用胎儿镜行脐带血管穿刺，但由于并发症高，应用受到限制。n n1983年，Ternand Daffos超声引导下经皮脐血管穿刺取血（Cordocentesis）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐带血穿刺时间n16周分娩（最佳2428周）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐带血穿刺取血量n n35mln n20周后抽取68ml对胎儿循环无不良影响产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐带血穿刺适应症n n胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的胎儿核型分析或基因检测（胎儿畸形、严重的FGRFGR、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培、羊水或绒毛细胞培养失败、羊水或绒毛培养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性养结果为嵌合体、非免疫性胎儿水肿、脆性X X综合综合症等）症等）n n胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等）胎儿血液疾病分析（血型、血小板计数等）n n胎儿感染（弓形虫、病毒感染等）胎儿感染（弓形虫、病毒感染等）n n胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等）胎儿情况评估（酸碱平衡、甲功等）n n遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、遗传性疾病（单基因病、凝血障碍、血红蛋白病、代谢性疾病等）代谢性疾病等）n n胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）胎儿治疗（宫内输血、宫内药物治疗等）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐带血穿刺并发症n n穿刺部位的出血n n脐带血肿n n短暂性胎心减慢n n宫内感染n n胎儿丢失（流产、早产）n n大多数并发症为短暂性和非致命性产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐带血穿刺并发症胎儿丢失n nMaxwell 1991年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率为1%（1/76）；异常超声者流产率为7%（5/76）；胎儿结构明显异常者流产率为25%（9/36）n nAntsaklis 1998年报道胎儿超声结构筛查示正常超声者脐穿的流产率1%（2/191）；异常超声者流产率为13%（11/84）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐带穿刺部位产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐血穿刺确定胎儿血样n n血红蛋白电泳n nKleihauer-Betke试验：胎儿红细胞在酸中稳定n nAPT试验：NaOH中胎儿血为粉红色n n有核红细胞的出现产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐血穿刺排除脐血中母血污染n nX染色体DMD基因内部5对CA重复序列的连锁分析产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛组织、羊水细胞、脐血细胞培养产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛组织的培养n n直接法n n培养法（悬浮培养、贴壁培养）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛组织的染色体检查直接法n n孕早期Langhans细胞有较高的有丝分裂活性，能提供足以分析的良好有丝分裂相，较绒毛培养简易可靠、操作简单快速产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛组织的染色体检查直接法n n绒毛组织的分离洗脱绒毛组织的分离洗脱n n加秋水仙素（终浓度加秋水仙素（终浓度2ug/ml2ug/ml，可一次加，也可分，可一次加，也可分次少量加）次少量加）n n3737O OC 5%COC 5%CO2 2培养箱培养培养箱培养4545分钟分钟n n低渗（低渗（1%1%枸橼酸钠低渗枸橼酸钠低渗1010分钟或分钟或1%1%枸橼酸钠和枸橼酸钠和0.075mol/l 10.075mol/l 1：1 1低渗低渗4040分钟）分钟）n n预固定（甲醇：冰醋酸预固定（甲醇：冰醋酸 3 3：1 1）1010分钟分钟n n固定（甲醇：冰醋酸固定（甲醇：冰醋酸 3 3：1 1）10-2010-20分钟分钟n n冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打）冰醋酸解离绒毛细胞（轻吹打）n n制片制片产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛组织的染色体检查悬浮培养法n n绒毛挑选洗脱n n绒毛组织剪成小块入培养瓶（25ml培养瓶每瓶10mg）n n加特定培养液3mln n培养3-6天n n收获（加秋素、低渗、固定、制片）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院绒毛组织的染色体检查贴壁培养法n n绒毛组织挑选洗脱n n绒毛组织剪成小块n n加0.25%+0.02%EDTA 5ml 37OC 摇床中20分钟n n加培养基终止消化，离心后弃上清加培养基接种培养5-10天n n收获产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊水细胞培养细胞类型n n成纤维样细胞（F细胞）n n上皮样细胞（密集型上皮样细胞-E细胞、镰刀样上皮细胞、圆形上皮细胞）n n羊水样细胞（AF细胞）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊水细胞培养收获方法n n原位法n n消化法n n刮取法产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊水细胞培养中存在的问题 污染n n细菌n n真菌n n支原体n n病毒n n其他细胞产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊水细胞培养中存在的问题 母体细胞污染n n若胎儿为男性，由于母体细胞污染误将胎儿诊断为嵌合体n n母体细胞在培养中占优势产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊水细胞培养中存在的问题 母体细胞污染的预防n n羊水穿刺时，把最先抽得的1-2ml羊水弃掉n n染色体多态现象的测试n n羊水细胞、母体细胞 的HLA组织定型鉴别产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊水细胞培养中存在的问题 细胞不生长、不贴壁n n最常见的原因是支原体污染n n培养基PH不适当，偏酸（6.4或偏碱7.4均不利n n最合适的穿刺时间16-20周产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院羊水细胞培养中存在的问题 细胞及染色体收获少n n每天观察细胞生长（梭形细胞背景上有透明透亮的圆形细胞）n n滚圆的细胞与有丝分裂的圆形细胞鉴别n n操作应轻柔，胰酶消化法要掌握好胰酶消化的时间n n羊水中胎脂多时3-5天可轻轻动一动，减少胎脂贴壁占据空间n n低渗时间短于外周血（一般3-5分钟）产前诊断中心产前诊断中心南京鼓楼医院南京鼓楼医院脐带血细胞培养n n量少于外周血（一般5ml注射器小于14滴）n n其他同外周血