14基因诊断与基因治疗hba.pptx

第二十一章基因诊断与基因治疗1第一节基因诊断一、基因诊断的含义基因诊断（genediagnosis）亦称分子诊断、DNA诊断。采用分子生物学的技术方法来分析受检者的某一特定基因的结构（DNA水平）或功能（RNA水平）是否异常，以此来对相应的疾病进行诊断。2二、基因诊断的原理及方法1基因诊断的原理检测相关基因的结构及其表达功能特别是RNA产物是否正常2基因诊断的方法（1）DNA诊断（2）RNA诊断3（1）DNA诊断1）限制性片段长度多态性2）等位基因特异的寡核苷酸探针杂交（allele-specificoligonucleotideprobe,ASOprobe）3）单链构象多态性（SSCP）4）DNA序列分析（2）RNA诊断1）RNA印迹（Northernblot）2)RT-PCR41）限制性片段长度多态性基因连锁基因连锁分析（1）方法原理：）方法原理：待待测测DNA序序列列中中的的点点突突变变导导致致了了某某一一限限制制性性内内切切酶酶识识别别位位点点的的改改变变可可引引起起其其特特异异的的限限制制性性内内切切酶酶片片段段的的大大小小与与多多少少随随之之改改变变，即即而而通通过过Southern印印迹迹杂杂交交和和限限制制性性内内切切酶酶酶酶谱谱分分析析诊断出点突变。诊断出点突变。56（2）诊断原理）诊断原理在人群中，个体间在人群中，个体间DNA的核苷酸序列的核苷酸序列存在差异，称为存在差异，称为DNA多态性。多态性。DNA多态性多态性可以改变限制性内切酶的切割位点，产生可以改变限制性内切酶的切割位点，产生DNA限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlenthpolymorphism,RFLP）。）。67RFLP按照孟德尔方式遗传，在某一特定按照孟德尔方式遗传，在某一特定家族中，如果某一种致病基因与特异的家族中，如果某一种致病基因与特异的多态性片段紧密连锁，就可利用这一多多态性片段紧密连锁，就可利用这一多态性片段作为一种遗传性标志来判断家态性片段作为一种遗传性标志来判断家族成员或胎儿的基因组中是否携带致病族成员或胎儿的基因组中是否携带致病基因基因。78 89（2）应用）应用Asickle-cellanemia的基因诊断的基因诊断a.病因病因血血红红蛋蛋白白中中的的珠珠蛋蛋白白N端端第第6位位氨氨基基酸酸正正常为谷氨酸，贫血时突变为颉氨酸。常为谷氨酸，贫血时突变为颉氨酸。9101234561011b.b.检测检测限制性内切酶：限制性内切酶：Sau1 Sau1 酶切位点：酶切位点：CCTNAGG CCTNAGG探针：探针：标记的标记的珠蛋白珠蛋白1112c.结果分析结果分析切切割割正正常常待待测测血血红红蛋蛋白白珠珠蛋蛋白白，DNA与与探探针针杂交后产生杂交后产生1.1kb切切割割异异常常待待测测血血红红蛋蛋白白珠珠蛋蛋白白，DNA与与探探针针杂交后产生杂交后产生1.3kb121313141415（1）原理）原理根据已知的基因突变位点的核苷酸序列，根据已知的基因突变位点的核苷酸序列，人工合成相应于突变基因异人工合成相应于突变基因异常核苷酸序列的常核苷酸序列的寡核苷酸作为杂交探针，从而直接检测和鉴定寡核苷酸作为杂交探针，从而直接检测和鉴定突变基因。突变基因。2）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法（allelespecificoligonucleotide,ASO）1516相应于突变基因异常相应于突变基因异常相应于正常基因相应于正常基因核苷酸序列的寡核苷核苷酸序列的寡核苷核苷酸序列的寡核苷核苷酸序列的寡核苷杂交探针杂交探针酸杂交探针酸杂交探针与受检者与受检者DNA进行分子杂交进行分子杂交发生杂交发生杂交 均均可可杂杂交交 与异常与异常 不发生杂交不发生杂交(突变纯和子突变纯和子 ）（杂杂和和子子）与正常发生杂交与正常发生杂交(正常纯和子正常纯和子 ）161717181）病因）病因H-ras（化学诱导）（化学诱导）ras家族家族K-ras编码编码P21蛋白蛋白N-ras（自然发生（自然发生)ras家族点突变好发于家族点突变好发于12、13、61位密码子位密码子（2 2）应用）应用 大肠癌大肠癌K-ras K-ras 的基因诊断的基因诊断18192）检测）检测a、PCR扩增扩增 用人工合成的位于待测点突变两侧的引用人工合成的位于待测点突变两侧的引物，分别扩增含物，分别扩增含12、13、及、及61位点的基因片位点的基因片段。段。1920b、ASO分析分析 将扩增产物结合在尼龙膜上分别与将扩增产物结合在尼龙膜上分别与rasras原癌原癌基因密码子基因密码子1212、1313、6161所有可能引起碱基突变所有可能引起碱基突变的寡核苷酸探针进行杂交；的寡核苷酸探针进行杂交；杂交后，膜经严格的洗涤，仅允许完全相配杂交后，膜经严格的洗涤，仅允许完全相配的杂交双链存在；的杂交双链存在；针结合处在光胶片上呈阳性斑点针结合处在光胶片上呈阳性斑点2021223）mRNA的检测的检测（1）原理）原理通过对通过对mRNA进行定量、检测其进行定量、检测其剪接剪接加工的缺陷以及外显子变异等判断基因能加工的缺陷以及外显子变异等判断基因能否转录、转录物（否转录、转录物（mRNA）是否正常以及）是否正常以及转录效率的高低。转录效率的高低。2223*mRNA不稳定可将其转为不稳定可将其转为cDNA再用再用PCR技术进行研究（技术进行研究（RT-PCR）2324（2）应用）应用视网膜母细胞瘤：视网膜母细胞瘤：Rb基因缺陷基因缺陷Rb1基因的基因的mRNA全长全长4.7kb采用采用RT-PCR技术分析外显子突变或技术分析外显子突变或mRNA前前体剪接异常。体剪接异常。2425分析外显子分析外显子19至至22间的基因突变间的基因突变逆转录引物：外显子逆转录引物：外显子22反义链序列反义链序列5-GGTACCGTGGAAGCTTACTGCAAAT-3 PCR引物引物:外显子外显子22正义链序列正义链序列5-CCATGGGACCTTCGAATGACGTTTA-3外显子外显子19正义链序列正义链序列5-GAATTCGTATCTTTCTCCTGTAAGAT-32526用用RT-PCR检测艾滋病检测艾滋病26三、基因诊断的应用1.遗传疾病的诊断产前诊断、遗传病易感性2感染性疾病（1）病毒性感染（2）细菌性感染（3）寄生虫（4）其他273恶性肿瘤4法医学中应用28（1）DNA指纹分析（DNAfingerprinting）可变串联重复序列小卫星DNA（variablenumberoftandemrepeat,VNTR）29（2）短串联重复（shorttandemrepeat,STR）多态性分析微卫星DNASTRPCR30第二节第二节基因治疗的基本概念和基因治疗的基本概念和基本策略基本策略一一基因治疗（基因治疗（genetherapy）的概念）的概念1、背景与历史、背景与历史疾病的分子生物学了解疾病的分子生物学了解新技术新方法（特别是重组新技术新方法（特别是重组DNA）的迅速）的迅速发展发展311989年年5月月28日日第一个基因标记计划第一个基因标记计划（TIL-NeoR）1990年年9月月11日日第一个基因治疗计划第一个基因治疗计划（ADA-SCID）321995年年NIH组组织织Orkin、Motoksy对对头头5年基因治疗评估年基因治疗评估3点点建议：建议：发展载体技术发展载体技术疾病的分子机制疾病的分子机制动物模型动物模型成立成立3个国家实验室个国家实验室2000年年2月月532个计划，个计划，3400余个病人余个病人33病种：恶性肿瘤病种：恶性肿瘤62.2%遗传性疾病遗传性疾病13.3%AIDS6.8%心血管疾病心血管疾病6.8%其他其他1.3%342、定义、定义基因角度：基因角度：正常或有功能的基因置正常或有功能的基因置换或增补缺陷基因。换或增补缺陷基因。治疗角度：治疗角度：新的遗传物转移到某个新的遗传物转移到某个体获治疗效果。体获治疗效果。353、方式、方式基因矫正和置换基因矫正和置换:同源重组同源重组基因增补基因增补:ADA、血友病血友病基因封闭基因封闭:myc基因过度表基因过度表达，反义抑制达，反义抑制活化前体药物基因治疗：活化前体药物基因治疗：36单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因导入导入肿瘤细胞肿瘤细胞合成合成HSV-TK无毒性的抗病毒无毒性的抗病毒有毒性的抗病毒有毒性的抗病毒药物（药物（GCV）药物（药物（GCV三磷酸）三磷酸）细胞死亡细胞死亡374、导入方式、导入方式exvivo基因转移基因转移invivo基因转移基因转移38第三节第三节基因治疗的条件基因治疗的条件1、目的基因的种类：目的基因的种类：细胞因子、缺陷基因、抑癌基因、细胞因子、缺陷基因、抑癌基因、受体基因受体基因391、目的基因的获得方法目的基因的获得方法1）真核基因组真核基因组DNA文库中文库中目的基因的克隆目的基因的克隆2）cDNA文库中目的基因的文库中目的基因的克隆克隆3）人工合成基因片段人工合成基因片段4）PCR法筛选扩增目的基因法筛选扩增目的基因401、外源基因的要求外源基因的要求1）含信号肽的含信号肽的cDNA，序列，序列正确正确2）必要的调控元件（顺式必要的调控元件（顺式作用元件作用元件启动子、增强启动子、增强子、静止子）子、静止子）413）外源基因进入细胞核转录，外源基因进入细胞核转录，再转移至细胞浆，间隔序再转移至细胞浆，间隔序列（内含子），剪接信号列（内含子），剪接信号（SA,SD）PolyA信号，核信号，核内转录因子内转录因子4）翻译的起始密码子、终止翻译的起始密码子、终止密码子、内核糖体进入位密码子、内核糖体进入位点（点（IRES）元件）元件5）外源基因的丢失、失活、甲基外源基因的丢失、失活、甲基化化424、基因治疗的靶细胞（、基因治疗的靶细胞（targetcell）1）生殖细胞生殖细胞全世界受严格控制全世界受严格控制2）体细胞体细胞选择的标准：选择的标准：A、容易取出和移植容易取出和移植B、容易体外培养容易体外培养C、目的基因高效导入目的基因高效导入D、细胞寿命长细胞寿命长43常用靶细胞；常用靶细胞；自体、自体、同种异体、同种异体、异种、异种、淋巴、骨髓、皮肤、肝、肌、淋巴、骨髓、皮肤、肝、肌、肿瘤细胞等肿瘤细胞等4445基因导入的方式：基因导入的方式：exvivo体外将基因导入体外将基因导入targetcell,然后将此修饰过然后将此修饰过的细胞回输给病人的细胞回输给病人。Invivo外源基因直接导入体外源基因直接导入体内有关的组织器官。内有关的组织器官。463、基因导入（转移）的工具与方法。基因导入（转移）的工具与方法。将将外外源源基基因因或或DNA片片断断导导入入宿宿主主细细胞胞进进行行扩扩增增或或表表达达，需需要要有有一一个个能能在在该该宿宿主主细细胞胞进进行行复复制制和和表表达达的的载载体体（vector）来来携携带带。前前者者与与后后者者在在体体外外构构成成重重组组DNA分子，然后导入宿主细胞分子，然后导入宿主细胞。471）非病毒方法）非病毒方法4849（一）磷酸钙转染技术（一）磷酸钙转染技术磷酸钙磷酸钙-DNA导入细胞导入细胞吞噬体吞噬体转运转运细胞器细胞器瞬时瞬时稳定稳定外源基因存在外源基因存在外源基因非特异外源基因非特异于染色体于染色体DNA外外与宿主染色体与宿主染色体DNA重组重组12小时内表达小时内表达持续约持续约3-4天天降解降解稳定转化细胞株稳定转化细胞株50（二）（二）DEAE-葡聚糖转染技葡聚糖转染技术（略）术（略）51（三）脂质体转染法（三）脂质体转染法（20%）聚阳离子脂质体聚阳离子脂质体-DNA脂质体脂质体DNA阳离子复合物阳离子复合物负电荷的细胞膜吸收此复合物负电荷的细胞膜吸收此复合物（融合吸收）（融合吸收）优点：简便、低毒性、无免疫原性、优点：简便、低毒性、无免疫原性、无病毒产生、化学成分已知可无病毒产生、化学成分已知可大量商业供应大量商业供应缺点：转染效率低，短暂表达缺点：转染效率低，短暂表达52（四）电穿孔转染技术（四）电穿孔转染技术靶细胞（悬浮态）靶细胞（悬浮态）+外源目的外源目的DNA电穿孔仪电穿孔仪高压电脉冲高压电脉冲靶细胞膜发生瞬时可逆性破裂靶细胞膜发生瞬时可逆性破裂形成微孔形成微孔外源目的外源目的DNA进入靶细胞进入靶细胞53（五）基因枪技术（五）基因枪技术电子发射装置或高压气流电子发射装置或高压气流金金或或钨钨颗颗粒粒包包裹裹外外源源目目的的DNA形形成成“子子弹弹”打入靶细胞打入靶细胞54上述物理、化学方法转移基因上述物理、化学方法转移基因的缺点：的缺点：1）转移效率低，多应用于实转移效率低，多应用于实验研究验研究2）维持时间短维持时间短2、病毒方法病毒方法55在在以以基基因因治治疗疗为为目目的的的的载载体体系系统统中中，以病毒载体最为常用，其优点：以病毒载体最为常用，其优点：1）易于改造与操作易于改造与操作2）转移效率高转移效率高3）较高的靶细胞特异性）较高的靶细胞特异性56病毒载体：病毒载体：逆转录病毒逆转录病毒(retrovirus)载载体体用于具有分裂功能的用于具有分裂功能的细胞中进行基因转移细胞中进行基因转移与表达与表达57腺病毒腺病毒(adenovirus)、腺相关病毒、腺相关病毒(adeno-associated-virus用于非增殖性细胞用于非增殖性细胞中进行基因转移与表达中进行基因转移与表达58（六）逆转录病毒载体（六）逆转录病毒载体1、逆转录病毒的结构、逆转录病毒的结构由由2条相同的条相同的38S单链单链RNA组成组成2、逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期596061感染宿主细胞感染宿主细胞病毒基因组的整和病毒基因组的整和原病毒原病毒DNA的转录与翻译的转录与翻译逆转录病毒颗粒的释放逆转录病毒颗粒的释放623、原病毒、原病毒DNA的结构特点的结构特点63644、逆转录病毒载体的构建、逆转录病毒载体的构建65665、包装细胞系的构建、包装细胞系的构建1）没有包装细胞，逆转录病毒）没有包装细胞，逆转录病毒载体就不能装配成假载体就不能装配成假病毒颗粒感染靶细胞，病毒颗粒感染靶细胞，完完成外源基因的高效转移成外源基因的高效转移672）去除莫洛尼氏小鼠去除莫洛尼氏小鼠5端含有包装信号端含有包装信号一段序列一段序列辅助病毒辅助病毒整和整和NIH3T3染色体染色体形成形成包装细胞系包装细胞系转录编码病毒结构基因转录编码病毒结构基因携带外源基因的逆携带外源基因的逆不不能能包包装装成成病病毒毒颗颗粒粒转转录录病病毒毒载载体体（含含有有包包装装信信号号）导入该细胞系导入该细胞系提供提供病毒结构基因病毒结构基因提供提供包装信号包装信号包装成仅含有外源目的基因假病毒包装成仅含有外源目的基因假病毒686、逆转录病毒、逆转录病毒-包装细胞系的包装细胞系的特点特点1）感染增殖分裂的细胞感染增殖分裂的细胞2）转移效率高转移效率高3）有效整和、传代有效整和、传代4）宿主范围广宿主范围广（七）腺病毒载体（七）腺病毒载体1、腺病毒载体的结构、腺病毒载体的结构6970713、腺病毒载体的特点、腺病毒载体的特点1）可感染非增殖分裂的细胞可感染非增殖分裂的细胞2）易于培养与储存易于培养与储存3）非整和非整和4）可致免疫反应可致免疫反应（八）质粒（八）质粒DNA直接注射直接注射72基因治疗的基本过程基因治疗的基本过程73靶基因靶基因+载体载体重组重组DNA分子分子靶细胞靶细胞病人病人74举例：举例：细胞因子修饰肿瘤细胞降细胞因子修饰肿瘤细胞降低其致瘤性提高其免疫原性低其致瘤性提高其免疫原性751、靶基因靶基因：细胞因子（：细胞因子（-TNF,IL-2,-IFN,等）等）2载载体体：逆转录病毒逆转录病毒LTRgagpolenvLTR76逆转录病毒载体逆转录病毒载体PLN系列：系列：LTRNEOLTR773、包装细胞：包装细胞：PA317,包装包装为病毒为病毒4、感染靶细胞、感染靶细胞5、在靶细胞中表达基因产物在靶细胞中表达基因产物78基因治疗的安全性问题基因治疗的安全性问题:2次事故次事故靶向性、效、基因整合位靶向性、效、基因整合位点、表达调控点、表达调控79基因敲除（基因敲除（knockout）与基因添加）与基因添加（knockin）遗传工程生物中，一个正常基因可被几种遗传工程生物中，一个正常基因可被几种方式所改变方式所改变方法方法1：正常基因完全被基因的突变拷贝所替换正常基因完全被基因的突变拷贝所替换可以在没有正常基因的可以在没有正常基因的干扰下提供突变干扰下提供突变基因活性的信息基因活性的信息80方法方法2正常基因彻底失活正常基因彻底失活应用于获得正常基因在整体生应用于获得正常基因在整体生物中的可能功能的信息物中的可能功能的信息方法方法3一个突变基因加入到基因组一个突变基因加入到基因组最易进行的遗传工程最易进行的遗传工程8182转基因动物的概念转基因动物的概念用实验方法把外源基因导入动物的受用实验方法把外源基因导入动物的受精卵，再将这一受精卵接种到借腹怀孕精卵，再将这一受精卵接种到借腹怀孕的寄养雌性动物（的寄养雌性动物（fostermother）的子）的子宫内，使之发育繁殖，这时外源基因与宫内，使之发育繁殖，这时外源基因与动物本身的基因组整合，外源基因就能动物本身的基因组整合，外源基因就能随细胞分裂而增殖，再体内表达，并传随细胞分裂而增殖，再体内表达，并传给下一代，这样生育的动物称为给下一代，这样生育的动物称为转基因动物8384小鼠基因置换过程的总结小鼠基因置换过程的总结8586动物药厂的基本概念动物药厂的基本概念8788