微生物的生长和纯培养.pptx

微生物的生长和纯培养在微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养。在微生物学中培养和发酵两个概念是相同。在工业上大规模的进行微生物培养称为微生物发酵。第一节 微生物生长测定描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。（一）微生物细胞数目的检测法直接法（血球计数板、比例计数法）间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法）（二）微生物生长量和生理指标测定法直接法(干重法，堆体积法)间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）一、直接计数法1、显微计数法（血球计数板法）原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。2、比浊法（比色发）原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。3.平板菌落计数法技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作；注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物；误差：多次稀释造成的误差是主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作。4、干重测定法 将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约10-1210-13g。该法适合菌浓较高的样品。如大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。5、菌丝长度测定法该法适用于对丝状真菌生长长度的测定。方法：将真菌接种在固体培养基的平皿中央，定时测定菌落的直径或面积，直到菌落覆盖整个平皿。缺点：不能反映菌丝的纵向生长，不能计算菌落的厚度和培养集中的菌丝。接种量也能影响结果，不能反映菌丝的总量。也可用U型管培养法，该法方便不易污染，但通气不良。6、细胞堆积体积测定法方法：将细胞悬浮液装入毛细沉淀管内，离心，根据堆积体积计算含菌量。该法快速、简便，培养液中如有其他固体颗粒，则误差较大。也可以用有刻度的离心管离心，通过所得的沉淀体积推算出细胞的质量。7、电子计数器法方法：在计数器中放有电解质及两个电极，将电极一端放入带微孔的小管，通电抽真空，使含有菌体的电解质从小孔进入管内。当细胞通过小孔时，电阻增大，电阻增大会引起脉冲变化，则每个细胞通过时均被记录下来。因样品的体积已知，故可以计算菌体的浓度，同时菌体的大小与电阻的大小成正比。该方法方便、快捷，但不能测定含有颗粒的菌液，对链状和丝状菌无效。8、液体稀释法 9、薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。10、涂片染色法应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代入公式：每ml原菌液含菌数=视野中平均菌数涂布面积/视野面积 100 稀释倍数 二、间接测定法1、测定细胞的组分含量进行估算（1）测定DNA的含量（2）测定蛋白质的含量（3）测定ATP的含量 2、从培养基中的某营养物的消耗来估算 3、从菌体代谢产物来估算 4、从发酵液的黏度来估算 5、从发酵的放热量估算 6、从发酵液的酸碱度来估算 测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。第二节 微生物的生长规律 由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。获得同步生长的方法主要有两类：环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。一、单细胞微生物的群体生长曲线 单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长是以群体中细胞数量的增加来表示的，由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时，代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时也称为倍增时间。单位时间内繁殖的代数成为生长速率。图中表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。从图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。以细菌为例介绍单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。生长曲线：把少量的细菌接种到合适的液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定单位体积的细胞数，并绘制所得的曲线：以细菌细胞数目的对数作纵坐标，以培养时间为横坐标，得出细菌在生长过程中的曲线图。根据生长曲线的变化规律，可分为延迟期、对数生长期、稳定期、衰亡期四个阶段。微生物的生长规律 延滞期 对数生长期 稳定期 衰亡期 单细胞微生物的典型生长曲线细胞数目的对数 微生物的生长曲线将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。1、延迟期 是微生物细胞进入新环境的适应时期，也是细胞调整其大分子和小分子物质的组成（包括酶和细胞结构成分）又称为调整期。微生物延迟期的长短以细菌、酵母较短，霉菌次之，放线菌最长。其它名称：停滞期、调整期、适应期。现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。特点：生长速率常数=0；细胞形态变大或增长；细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强；合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶；对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素、化学药物、辐射等）原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物。影响延滞期长短的因素菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短。接种物菌龄：用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期。接种量：一般来说，接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）。培养基成分：在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。对实践的指导意义：在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；采取的缩短延迟期的措施有：增加接种量；（群体优势-适应性增强）采用对数生长期的健壮菌种；调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。选用繁殖快的菌种在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌 2、对数生长期 代时以G表示，生长速率已R表示，设t1时刻的菌数为N1，经过n次分裂后，t2时刻的菌数为N2 例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（B），经4h（t）后增加到49，000，000（b），这样，n(lg4.9107lg1.2104）0.30112借助于 n 和 t，还可以计算出不同培养条件下的代时G，G t/n在本例中，G 460/12 20min该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为13h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。一些细菌的代时 菌名 培养基 培养温度 代时E.coli（大肠杆菌）肉汤 37 17minE.coli 牛奶 37 12.5Enterobacter aerogenes（产气肠细菌）肉汤或牛奶 37 1618E.aerogenes 组合 37 2944B.Cereus（蜡状芽孢杆菌）肉汤 30 18B.thermophilus（嗜热芽孢杆菌）肉汤 55 18.3Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌）牛奶 37 6687Streptococcus lactis（乳酸链球菌）牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉汤 37 48Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌）肉汤 37 23.5Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌）葡萄糖 25 34446 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 79293 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌）组合 27 1200 不同温度下的代时 温度对微生物的代时有明显影响：E.Coli 在不同温度下的代时温度（）代时（分）温度（）代时（分）10 860 35 22 15 120 37 17 20 90 40 17.5 25 40 45 20 30 29 47.5 77 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。特点：（1）生长速率常数最大，即代时最短；（2）细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致；（3）代谢最旺盛；（4）细胞对理化因素较敏感影响因素：（1）菌种（2）营养成分（3）营养物浓度（4）培养温度对实践的指导意义：由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄；发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。营养物浓度与对数期生长速率和产量作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量。生长限制因子生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子。8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收获量受影响生长速度和最大收获量受影响时间3、稳定期又称：恒定期或最高生长期特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。产生原因：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，如碳氮比不合适；有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等）；物化条件（pH、氧化还原势等）不合适。对实践的指导意义：（1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：补充营养物质（补料即流加）调pH 调整温度（2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。生长产量常数（Y，或生长得率）：概念：表示微生物对基质利用效率的高低 Y=菌体干重/消耗营养物质的浓度 根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量。如：Y=0.5，表示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄糖）10g。四、衰亡期特点：细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现所谓的负生长。细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。微生物生长与代谢产物形成的关系：微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般认为：初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。lg 细胞数或产物浓度时间细胞 产物I型 II型主要的生长参数迟缓时间：实际达到对数生长期所需时间与理想条件下达到对数期所需时间之差。延缓生长量反映了迟缓期给细胞物质的工业化生产造成的损失。比生长率：表示生长速度与生长基质浓度之间的关系，当营养物质浓度很低时，比生长率与营养物质浓度成正比。总生长量：通过培养获得的微生物总量与原来接种的微生物量之差值。产量常数：总生长量与消耗基质总量之比。第三节 微生物的分离和纯培养一、无菌技术 无菌技术：是将微生物分离、转接及培养时防止被其它微生物污染的技术。1、对使用的器皿及用具的灭菌 2、对培养基的灭菌 通常使用的方法有高温蒸汽灭菌和高温干热灭菌，效果达到无菌（不含任何微生物)。3、无菌的环境（1）在操作过程中的无菌要求：接种、分离过程的无菌效果（在火焰上部进行操作）。（2）在超净工作台、无菌室和无菌箱中进行操作。使用甲醛、紫外线、75%的乙醇等进行预处理及其他的必要措施。（3）如进行好氧培养需对空气进行处理，实验室用多层纱布、棉塞和硅胶塞过滤空气，工业中使用空气过滤器过滤空气。二、微生物的分离方法 1、平皿划线分离法 将灭好菌的琼脂培养基倒入培养皿中，凝固后用接种针取少量的需分离菌，在培养基的表面上进行划线，经培养后形成菌落。菌落在划线开始处较密集，在划线的结束处少，当有单个孤立的菌落时，就达到分离的目的。划线的方法有：连续划线法、扇形划线法、方格划线法和平行划线法。特点：快速、方便。分区划线适用于浓度较大的样品；连续划线适用于浓度较小的样品；连续划线划线分离后平板上显示的菌落照片 2、稀释分离法（1）液体稀释法（1）液体稀释法 首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物。如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来的纯培养物。这种方法适合于细胞较大的微生物。（2）稀释倒平板法 首先将待分离的样品进行连续稀释，取一定稀释度的样品涂布平板或者取一定稀释度的样品和熔化的营养琼脂混合（对于热敏感菌不适用），培养到平板上长出单一的菌落。对于涂布平板的样品菌落通常仅张在平板的表面，对于与营养琼脂混合的样品菌落通常出现在平板的表面和内部。（3）涂布平板法 将经过稀释的样品滴加入已制好并灭好菌的培养皿表面，用灭好菌的涂布棒将菌液均匀 的涂抹在整个平板上，经培养长出单一菌落。具体分为两种方法：将0.1ml样品加入固体培养基表面，用无菌涂布棒均匀涂抹进行培养（适用于某些严格好氧菌）或者将样品加入到无菌的培养皿中，加入4550 固体培养基迅速混匀进行培养。3、单细胞（单孢子）挑取法 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。4、选择性培养分离法 为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。利用选择培养基进行直接分离富集培养 三、微生物的培养 1、好氧培养和厌氧培养 好氧培养以空气为氧的来源。实验室的培养方法用平皿培养和斜面培养；工业生产时用自然对流和机械通风法来供氧；液体培养时微生物利用培养液中的溶解氧；液体三角瓶培养时利用摇床机达到供氧的目的；发酵罐培养时用通入无菌压缩空气达到供氧的目的。厌氧培养是通过隔绝空气或驱除氧气的方法来实现的。实验室培养时，可将菌种接种到固体、半固体培养基的深层进行培养，同时加入还原剂；也可将厌氧微生物放入真空干燥器，抽出空气，并充入氮气或氮气和二氧化碳的混合气体。2、分批培养和连续培养 分批培养：将微生物置于一定容积的、定量的培养基中培养，培养基一次性加入，不再补充和更换，最后一次性收获。分批培养的过程中菌体、各种代谢产物的数目与营养物的数目呈负相关性。当微生物生长及基质变化达到一定时，菌体生长则会停止。在发酵工业中可用中间补料或连续流加物料，使培养基中营养物质的浓度保持在适合菌体生长和有利于菌体积累代谢产物的环境中。连续培养：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。连续培养原理 当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。