物生化学实验报告-蛋白质分子量测定--凝胶层析法等--大学毕设论文.doc

生物化学实验报告姓名： 专业： 院系： 学号：实验一 蛋白质分子量测定-凝胶层析法一、 实验原理凝胶层析法是利用凝胶把分子大小不同的物质分开的一种方法，又叫做分子筛层析法，排阻层析法。凝胶本身是一种分子筛，它可以把分子按大小不同进行分离，如同过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒放在适宜溶剂中浸泡，使其充分戏液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物后，再以同一溶剂洗脱，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的缝隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，无论是天然凝胶还是人工凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶，人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶和葡聚糖凝胶，后者的商品名为Sephadex型的各种交联葡聚糖凝胶，它具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与被分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低得孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同分子量的物质。以下进一步来说明凝胶层析的原理。将凝胶装载柱后，柱床总体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由Vo，Vi与Vg三部分组成，即Vt=Vi+Vg+Vo。Vo称为“孔隙体积”或“外体积”又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面孔隙之间的水相体积，相应于一般层析柱法中内流动相体积；Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，Vg为凝胶本身的体积，因此Vt-Vo等于Vi+Vg。洗脱体积与Vo及Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数。它只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无光，也就是说它对每一物质为常数，与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可改写成：Kd=(Ve-Vo)/Vi上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶液通过实际测量求出；Vi可由g.Wr求得。因此，对一层析柱凝胶床来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积Ve就可算出它的Kd值。Vo表示外体积；Vi内体积；VeII、VeIII分别代表组分II和III的洗脱体积。Kd可以有下列几种情况：1、 当Kd=0时，则Ve=Vo。即对于根本不能进入凝胶内部的大分子物质，洗脱体积等于空隙体积。2、 当Kd=1时，Ve=Vo+Vi。即小分子可完全渗入凝胶内部时，洗脱体积应为空隙体积与内体积之和。可以看出，对某一凝胶介质，两种全排出的分子即等于零，虽然分子大小有差别，但不能有分离效果。同样两种分子如都能进入内部空隙，即Kd等于1，它们即使分子大小有不同，也没有分离效果。因此不同型号的凝胶介质，有它一定的使用范围。3、 当0<Kd<1时，Ve=Vo+KdVi。表示内体积只有一部分可被组分利用，扩散渗入，Vo即在Vo与Vo+Vi之间变化。4、 有时Kd>1时，表示凝胶对组分有吸附作用，此时Ve>Vo+Vi。例如一些芳香化合物的洗脱体积远超过理论计算的最大值，这些化合物的Kd>1。如苯丙氨酸，络氨酸和色氨酸在Sephadex G-25中的Kd值分别为1.2,1.4和2.2。 在实际工作中，对小分子物质也得不到Kd=1的数值，特别是交联度大的凝胶差别更大，如用G-10型得Kd值0.75左右，用G-25型得0.8左右。这是由于一部分水相与凝胶结合牢固，称为凝胶本身的一部分，因而不起作用，小分子不能扩散入内所致。此时Vi即不能以g.WR计算，此为也常有直接用小分子物质D2O,NaCl等通过凝胶柱而由实验计算出Vi值的。另一个解决的办法是不使用Vi与Kd，而用Kav代替Kd，其定义如下： 已知 Kd=（Ve-Vo）/Vi,Vt-Vo代替Vi,则： Kav=（Ve-Vo）/(Vt-Vo)即 Va=Vo+Kav(Vt-Vo)在这里实际上将原来以水作为固定相（Vi）改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相，而洗脱剂（Ve-Vo）作为流动相。Kav与Kd对交联的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logMK1和K2为常数，M为分子量，Ve也可用Ve-Vo,Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同，通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征，在允许的工作范围内，曲线逾陡，则分级逾好，而工作范围逾窄。凝胶层析主要决定于溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有自己得特殊的选择曲线，可用以测定未知的分子量，测定时以便用曲线的直线部分为宜。用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶的分子量，只要测定洗脱液中具有该酶最大活性的部分，然后测定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在PH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端PH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶-底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常。用凝胶层析法所测得分子量的结果，要和其他方法测定相对照，由此可以得到可靠的结论。凝胶层析技术操作方便，设备简单，周期短，重复性能好，而且条件温和，一般不引起生物活性的变化，目前得到广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热源动物以及用于测定高分子物质的分子量。二、实验步骤1、 将实现准备好的凝胶缓慢的注入层析柱中，注意连续加入凝胶不要使凝胶柱出现断层，凝胶柱中不能出现气泡；2、 待层析柱中凝胶注满后，计算每分钟层析柱下滴液体的滴数，调节液滴下滴速度，再计算液滴滴满2ml时所用的时间，记下该时间；3、 加样。用胶头滴管吸取0.8ml样品（蓝色葡聚糖酶，牛血清酶，胃蛋白酶，细胞色素C）缓慢的滴入层析柱内凝胶的表面，上面用洗脱液灌满，同时打开蛋白质核酸层析仪，设定好收集满2ml液滴所用时间。记下依次加入样品时所收集的洗脱液的体积。4、 测定收集的洗脱液在280nm时的吸光值5、 以洗脱体积为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制选择曲线。三、 实验结果1、 吸光度测定结果表 1第一次加样第二次加样第三次加样第四次加样编号吸光度编号吸光度编号吸光度编号吸光度编号吸光度编号吸光度10.04370.195130.051190.07250.039310.06820.05380.446140.114200.049260.049320.04930.05990.134150.121210.041270.099330.03740.064100.063160.067220.039280.18950.06110.064170.067230.04290.20160.065120.055180.151240.037300.1282、绘制洗脱曲线以洗脱体积为横坐标，OD值为纵坐标绘制洗脱曲线如下。图 13、绘制标准曲线表 2VeODMlgM4个峰值160.4462002.30103300.121671.826075360.151361.556303580.20113.71.136721以蛋白质分子量的对数lgM为横坐标，Ve为纵坐标，绘制标准曲线如下。图 2四、 实验结果分析1、实验过程中加样是很关键的步骤，加样太快容易造成重叠峰。2、 洗脱曲线四个峰值明显，表明四种蛋白质样品被有效的分开。3、 A样和B样，C样和D样之间洗脱体积差异不太大，有可能是后一个样加样时间提早了得缘故，致使两峰值之间的间距较小，会有分离不出，两峰重叠的可能。4、 根据蛋白质摩尔质量的对数和洗脱体积所作的标准曲线不是一条直线，可能是洗脱体积的误差。如果在实验过程中，收集洗脱液时出现气泡，会严重影响洗脱体积的计算，造成洗脱体积的计算不准确，从而造成误差。蛋白质分析仪也有可能造成机械误差。5、 从标准曲线看出，蛋白质的分子量所对应的洗脱体积偏小，最有可能造成的误差就是在洗脱蛋白质时出现气泡。为解决这一问题，可以多测量几次洗脱体积，取品均值后再作图案，可以减小误差。实验二 小麦种子储藏蛋白HMW-GS的分离（SDS-PAGE）一、实验目的利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）研究小麦种子储藏蛋白C高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS）组成结构。此外，SDS-PAGE也是测定蛋白质亚基分子质量的常用方法。通过本实验，掌握SDS-PAGE的基本原理、技术及应用。二、实验原理用十二烷基硫酸钠（SDS）和还原剂（巯基乙醇或二流苏糖醇）热处理蛋白质样品，蛋白质分子中的二硫键被还原，解离的亚基与SDS发生定量结合后使得蛋白质亚基带上大量负电荷，从而掩盖了蛋白质各种亚基间原有的电荷差异。亚基的构象均呈长棒状，各种蛋白质亚基- SDS复合物表现出相等的电荷密度，在电场中迁移速度仅与分子量有关。因此，SDS-PAGE可以用来分离蛋白质亚基并测定其分子质量。三、实验器材及试剂1.仪器电泳仪、垂直板电泳槽、台式高速离心机、脱色摇床、加样枪、烧杯50ml 2个，移液管2.试剂和材料70%乙醇、50%正丙醇（含2%-巯基乙醇）250ml、样品提取缓冲液、样品提取液、30%丙烯酰胺+甲叉双丙烯酰胺、分离胶缓冲液（Tris-HCl）pH8.8、浓缩胶缓冲液（Tris-HCl）pH6.8、10%AP溶液、染色液、漂洗液四、操作步骤1、样品的提取（1）取一粒种子研磨粉碎，加入70%乙醇1000ul，10分钟后，12000转离心8分钟；弃乙醇晾干。（2）加50%正丙醇（含2%-巯基乙醇）250ul混匀后，50水浴1.5小时，中途需震荡，12000转离心8分钟。（3）取上清夜加3倍体积丙酮置于-203小时。（4）12000转离心8分钟，倒掉丙酮晾干，加提取液250ul，待溶解完全后，在沸水浴煮沸2.5分钟，之后12000转再离心1分钟，上清液用于点样。2、SDS-PAGE分析（1）组装电泳槽：见电泳槽使用说明书（2）凝胶的制备：取两只干净烧杯（500ml）标号，按下表试剂配方惊醒制胶。在组装好的电泳槽中先制分离胶，待分离胶聚合后，倒掉乙醇溶液，再灌浓缩胶，灌好浓缩胶后迅速插入样品梳静置聚合。分离胶用量15ml，浓缩胶用量5ml。表1 凝胶的制备试剂配方聚丙烯酰胺凝胶组成分离胶（10%）浓缩胶（3%）30%Acr-Bis（ml）H2OpH8.8Tris-HCL(含SDS、TEMED)（ml）pH6.8 Tris-HCL(含SDS、TEMED)（ml）10%AP（ul）2.52.952.001000.623.001.375（3）加样及电泳 待凝胶聚合完全后，拔掉电泳梳子，然后将电泳槽注满电泳缓冲液，取适量上清液加样，在标准泳道点是上高分子标准蛋白质溶液。上槽接负极，下槽接正极，恒流200mA电泳。待溴酚蓝走出分离胶后30分钟停止电泳，取出玻璃板，剥胶染色。（4）染色 剥下的胶用蒸馏水洗涤后加入染色液，盖上盖子，放入微波炉低温染色4次，每次1分钟，取出震荡，取出。（5）脱色将染色液倒回瓶内，加入漂洗液洗，漂洗两次，每次1-2小时，照相保存。五实验结果分析 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得到四条大小不同的条带分离出蛋白质亚基并可知道其亚基的分子量，条带不是很平整可能是梳子没有插好，导致点样不好，也可能是本身做胶就不够好，使得条带不够整齐清晰。实验三 猪血中超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化及活力测定 一、实验目的通过本次实验熟悉掌握超氧化物歧化酶（SOD）的分离纯化方以及SOD活力的测定。二、实验原理：超氧化物歧化酶（SOD）是一种能专一地清除超氧阴离子自由基（O2-）的金属酶,它具有抗衰老，抗辐射、抗炎和抗癌等作用，因而在医药、化妆品、食品工业具有广泛的应用前景。SOD是一种酸性蛋白，对热、PH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。按照它含的金属离子的不同，可分为Cu-Zn-SOD，Mn-SOD，Fe-SOD等三种。Cu-Zn-SOD为二聚体，呈蓝绿色；Mn-SOD呈紫色；Fe-SOD呈黄褐色。SOD催化下述反应：2H+2O2-H2O2+O2。机体内O2-的过量和不足均对机体不利，SOD对过量的O2-的及时清除保证了机体内O2-的含量的相对平衡。机体内O2-的形成可分为生理性和病理性两方面。在一些正常生理过程中会形成一些O2-。例如：呼吸链中电子传递结果可产生一些O2-。在某些疾病过程中会产生大量的O2-。过量的O2-如不及时清除，会对细胞损伤。SOD将O2-歧化为H2O2，而过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化酶可催化过氧化氢分解，在机体内形成一套解毒系统，对机体起防护作用。本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD并进行纯化。酶活力测定可以用一下方法：邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法、肾上腺素自氧化法、亚硝酸法等。该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定，酶活性单位定义为：每毫升反应溶液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化率达50%的酶量定义为一个酶活单位。样品中蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质结合呈蓝色。在一定的范围内，溶液在595nm波长下光密度与蛋白质含量成正比，可用比色法测定，在测定范围1-1000ug。SOD同工酶鉴定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离。用“负”显色法，核黄素经光照所产生的活性氧O2-（氧自由基）能使氯化硝基四氮唑蓝（NBT）由黄色的氧化型转化为蓝色的还原型。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，经电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处显色为蓝色，而有SOD处则无色透明，由此可鉴定SOD同工酶的酶谱。三、 操作步骤1、 SOD的提取（1） 取新鲜猪血20ml（预先按0.5:1的比例加入ACD抗凝剂），4000r/m，10min，去上层血浆，取下层红血球粘稠液，并量其体积，然后加入2倍体积的0.9%NaCl溶液清洗，4000r/m，10min，弃上清液，得洗净的红血球浓稠液。（2） 向洗净的红血球中加入等体积的蒸馏水，剧烈搅拌30min，使其充分溶血。再向溶血液中缓慢加入预冷的0.25倍体积的95%的乙醇溶液和0.15倍体积的氯仿，均匀呈暗红色，再继续搅拌15min，4000r/m，10min，去变性蛋白沉淀物，得上层液，留样2ml。然后将清液在65-70°C恒温水浴中进行热处理，15min后取出迅速冷却至室温，4000r/m，5min，除沉淀，得浅黄色粗酶液，留样2ml。（3） 向粗酶液中加入等体积的丙酮溶液，冰箱中静置4h，4000r/m，10min弃上清液，得沉淀。将沉淀物用等体积的丙酮溶液洗二次，离心收集沉淀，自然干燥既得淡绿色成品，按1mg/ml溶于蒸馏水，备用。2、 SOD活力测定 （1）邻苯三酚自氧化率的测定 取4.5ml 50mmol/L PH 8.3的磷酸缓冲液，4.2ml蒸馏水和1ml 10mmol/L EDTA-Na2溶液，混匀后在25°C水浴保温20min，取出后立即加入25°C预热过的邻苯三酚溶液0.3ml，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，用10mmol/L HCl作空白，325nm波长下每隔30s测定光密度值一次，整个操作在4min内完成，计算出每分钟A325的增值，此即为邻苯三酚自氧化率。要求自氧化速率控制在0.07/mim左右。（2） 酶活力测定操作与（1）基本一致，加入邻苯三酚前，先加入0.1ml的SOD样液，蒸馏水则减少相应的体积，同理测其光密度值，计算加酶后邻苯三酚自氧化率。 （3）酶活性单位的计算根据酶活单位定义，按下列公式计算酶活性：单位活性（U/ml）=(A0-Am)/A0*100%)/50%)*反应液总体积数*（样液稀释倍数/样液体积）总活性（U）=单位活性测定*酶原液总体积 （4）蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G-250法） 标准曲线的制作：取6支试管，编号，按下表加试剂：表1.各试管加样量及对应蛋白质含量试剂管 号123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250(ml)555555蛋白质含量（ug）020406080100 盖上塞子，摇匀。注意各管振荡程度尽量一致。在595nm波长下比色测定光密度，比色应在1h内完成。以牛血清蛋白含量（ug）为横坐标，光密度值为纵坐标，绘出标准曲线。 样品中蛋白含量的测定将待测的SOD溶液并稀释到一定浓度，取1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，加入0.9ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝G-250试剂，其余操作与标准曲线制作相同。蛋白质含量计算根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量，计算其浓度。三、 实验结果1.测得邻苯三酚自氧化率：表 3时间(min)0.511.522.533.54A0.0180.0600.0980.1340.1670.2000.2320.261图 3 计算得：A0=0.069/min。酶活力测定中三个不同量样液的光密度值见下表：表 4时间(min)0.511.522.533.54样1(50l)0.2080.2170.2250.2320.2420.2490.2580.264样2(100l)0.0680.0730.0790.0840.0880.0930.0990.104样2(100l)0.0510.0530.0540.0550.0570.0610.0620.064计算（方法同1）得： A1=0.016/min；A2=0.0103/min；A3=0.004/min。酶活性单位的计算：单位活性（U/ml）=表 5样液体积(ml)酶原液总体积(ml)Am单位活性(U/ml)总活性(U)样10.05140.016314.89364408.511样20.112.50.0103172.60642157.58样30.150.004189.3617946.8085（1） 标准曲线的制作表4.标准曲线制作各试管加样量及光密度值试剂管 号123456蛋白质标准液（ml）00.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝G-250(ml)555555蛋白质含量（ug）020406080100光密度值（A595）00.1740.3410.4520.6200.729图2.蛋白质含量标准曲线（2） 样品蛋白质含量样品光密度测定值及蛋白质含量的计算结果如下表：表 6样号A595平均值蛋白质含量(g)蛋白质浓度(g/l)样10.28736.631861.8316样20.17119.176180.1918样30.118511.275980.1128（3） 数据处理表 7提纯步骤酶液总体积ml蛋白质mg/ml酶活性U/ml总活性U比活性U/mg回收率%纯化倍数除血蛋白上清141.8316314.89364408.51171.921001热变性后上清12.50.1918172.60642157.58899.9348.945.23丙酮沉淀后0.0117(g)0.1128189.3617946.811678.7421.489.76四、 实验结果分析1、 蛋白质含量标准曲线不是一条直线，可能是由于分光光度计的读数误差，也有可能是认人为误差。解决方法，可以多次测量取平均值，再舍去离标准曲线较远的点，使标准曲线两边的点数目尽量一样多，再绘制标准曲线，这样就可以减少偶然误差。2、 样品一的蛋白质含量过高，从后面的电泳图也可以看出样品1混有杂质，说明分离SOD同工酶时细胞可能有溶血。里面含有杂质，所以吸光值较大在标准曲线上所对应的蛋白质含量就过高，所以样品1的蛋白质含量不准确。3、 表3中邻苯三酚的自氧化率没有达到0.07/mim,可能会对后续实验结果造成影响，最大的影响就是使得所测样品中SOD同工酶抑制邻苯三酚的自氧化率会减小，从而计算出来的酶活性相应减小。4、 本实验纯化过程中，蛋白质含量、酶总活性逐渐降低，比活性逐渐增加。而酶活性本应随着酶纯度的增加而增大，但本实验没有这样的现象。SOD纯化倍数逐渐增加，最后达到约10倍，但是回收率却只有21%，偏低。说明本实验还存在很多问题，在操作时需要注意。19