第三章-固定化酶酶学教学课件.ppt

第三章第三章 固定化酶及酶的固定化固定化酶及酶的固定化固定化酶、是一种在空间运动上受到完全约束或局部约束固定化酶、是一种在空间运动上受到完全约束或局部约束的酶。近代工业化利用始于的酶。近代工业化利用始于1969年固定化氨基酰化酶的应年固定化氨基酰化酶的应用。利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，用。利用固定化技术，解决了酶应用过程中的很多问题，为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶能反复使为酶的应用开辟了新的前景。如可使所使用的酶能反复使用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续用，使产物分离提取容易，并在生产工艺上可以实现连续化和自动化，故在化和自动化，故在20世纪世纪70年代后得到迅速发展年代后得到迅速发展。其新。其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域的功能和新的应用正在迅速不断地扩展，是一项研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新技术。固定化酶固定化酶（Immobilized Enzyme）酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而酶在水溶液中不稳定，一般不能反复使用，而且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。且不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶针对这些限制酶广泛应用的因素，将水溶性酶或游离细胞或游离细胞经过化学或物理手段处理，将酶束缚经过化学或物理手段处理，将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃在一定的空间内，限制酶分子在此区间进行活跃的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶。的催化作用，成为不溶于水的固定化的酶。一、固定化酶的概念一、固定化酶的概念固定化酶固定化酶:固定在载体上，并在一定范围内固定在载体上，并在一定范围内进行催化反应的酶。进行催化反应的酶。二、固定化酶的制备方法二、固定化酶的制备方法(一一)吸附法吸附法（二）包埋法（二）包埋法（三）共价结合（偶联）法（三）共价结合（偶联）法（四）交联法（四）交联法（五）四种固定化酶制备方法的特点小结（五）四种固定化酶制备方法的特点小结固定化酶的制备方法的选择固定化酶的制备方法的选择固定化酶的制备方法、制备材料多种多样，不同的制备方法和材料，固定化后酶的特性不同。对于特定的目标酶，要根据酶自身的性质、应用目的、应用环境来选择固定化载体和方法。在具体选择时，一般应遵循以下几个原则。（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质心的构象。酶的催化反应取决于酶本身蛋白质分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损分子所特有的高级结构和活性中心，为了不损害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下害酶的催化活性及专一性，酶在固定化状态下发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又发挥催化作用时，既需要保证其高级结构，又要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。要使构成活性中心的氨基酸残基不发生变化。（2）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固）酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。能有效回收贮藏，利于反复使用。（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。这）固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。才能使之在制备过程中不易破坏或受损。（4）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应）固定化酶应有最小的空间位阻。固定化应尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高催化效率和产物的量。率和产物的量。（5）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程）固定化酶应有最大的稳定性。在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。化学反应。（6）固定化酶的成本适中。工业生产必须要考）固定化酶的成本适中。工业生产必须要考虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，虑到固定化成本，要求固定化酶应是廉价的，以利于工业使用。以利于工业使用。(一一)、吸附法、吸附法 吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体上而吸附法是通过物理方法将酶直接吸附在水不溶性载体上而使酶固定化的方法。使酶固定化的方法。次级键相互作用次级键相互作用 只需将酶液与具有只需将酶液与具有活泼表面活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上附的酶便能制得固定化酶。是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力。也最具有吸引力。根据吸附剂的特点又分为两种：根据吸附剂的特点又分为两种：物理吸附法物理吸附法(physical adsorption)(physical adsorption)是通过氢键、疏水键是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等微空玻璃等无机吸附剂无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等，纤维素、胶原以及火棉胶等有有机吸附剂机吸附剂。离子结合法离子结合法(ion binding)(ion binding)是指在适宜的是指在适宜的pHpH和离子强度和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团团的的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。最常用的交换剂有最常用的交换剂有CM-CM-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-纤维素、纤维素、DEAE-DEAE-葡聚糖葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97Amberlite XE-97、Dowe X-50Dowe X-50等。等。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。吸附法的优点：吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法的缺点吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，易脱落，：酶和载体的结合力不强，易脱落，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。会导致催化活力的丧失和沾污反应产物。世界第一例获得工业应用的固定化酶是世界第一例获得工业应用的固定化酶是 DEAE-DEAE-Sephadex A-25Sephadex A-25吸附的吸附的氨基酰化酶氨基酰化酶反应用于反应用于 DL-AADL-AA的光学分析。的光学分析。2.2.吸附法的优点、缺点吸附法的优点、缺点（二）、包埋法（二）、包埋法 1 1、凝胶包埋法（胶格包埋法）：、凝胶包埋法（胶格包埋法）：将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。将酶分子包埋在高聚物网格内的包埋方法。聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法包埋是最常用的包埋法 ：先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的先把丙烯酰胺单体、交联剂和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就酶混合，然后加入聚合催化系统使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，在酶分子周围形成交联的高聚物网络。它的机械强度高，并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联并可以改进酶脱落的情况，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上，可以减少酶的脱落。到高聚物上，可以减少酶的脱落。海藻酸钠海藻酸钠也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提也可以用来作为包埋载体，它从海藻中提取出来，可被多价离子取出来，可被多价离子CaCa2+2+、AlAl3+3+凝胶化凝胶化 ，操作简单经，操作简单经济。济。K-K-角叉莱胶（卡拉胶）角叉莱胶（卡拉胶）冷却成胶或与二、三价金属冷却成胶或与二、三价金属离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化离子成胶。包埋条件温和无毒性，机械强度好。固定化的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。的酶活回收率和稳定性都比聚丙烯酰胺法好。胶原和明胶胶原和明胶也是常用的包埋载体。也是常用的包埋载体。2 2、微囊化包埋法、微囊化包埋法微囊法微囊法主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶主要将酶封装在胶囊、脂质体和中空纤维中。胶囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业囊和脂质体主要用于医学治疗，中空纤维主要适于工业使用使用 。微囊制备方法微囊制备方法（1 1）界面沉淀法）界面沉淀法是一种简单的物理微囊化法，它是利用某是一种简单的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度较低而形成的皮膜将酶包埋。皮膜将酶包埋。（2 2）界面聚合法）界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。他所得的是用化学手段制备微囊的方法。他所得的微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发微囊外观好，但不稳定，有些酶还会因在包埋过程中发生化学反应而失活。生化学反应而失活。（3 3）表面活性剂乳化液膜包埋法）表面活性剂乳化液膜包埋法是在水溶液中添加表面活是在水溶液中添加表面活性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。性剂使之乳化形成液膜达到包埋目的的一种方法。包埋法的优点包埋法的优点在于它是一种反应条件温和、很在于它是一种反应条件温和、很少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。少改变酶结构但是又较牢固的固定化方法。包埋法的缺点包埋法的缺点是只有小分子底物和产物可以通是只有小分子底物和产物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大分子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大子的酶并不适合。这是由于高聚物网架会对大分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行分子物质产生扩散阻力导致固定化酶动力学行为改变，使活力降低。为改变，使活力降低。3.3.包埋法的优点、缺点包埋法的优点、缺点 1.共价偶联法中的几个影响因素共价偶联法中的几个影响因素（1 1）载体载体的物化性质要求载体的物化性质要求载体亲水亲水，并且有，并且有一定的一定的机械强度机械强度和和稳定性稳定性，同时具备在温和条件，同时具备在温和条件下与酶结合的下与酶结合的功能基团功能基团。（2 2）偶联反应的）偶联反应的反应条件反应条件必须在必须在温和温和pH、中中等离子强度等离子强度和和低温低温的缓冲溶液中。的缓冲溶液中。（3 3）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的）所选择的偶联反应要尽量考虑到对酶的其它功能基团其它功能基团副反应尽可能少副反应尽可能少。（4 4）要考虑到酶固定化后的）要考虑到酶固定化后的构型构型，尽量减少，尽量减少载体的载体的空间位阻空间位阻对酶活力的影响。对酶活力的影响。（1 1）共价偶联法的优点）共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合：得到的固定化酶结合牢固、稳定性好、利于连续使用。牢固、稳定性好、利于连续使用。（2 2）共价偶联法的缺点）共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，：载体活化的操作复杂，反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较反应条件激烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的高活力的固定化酶。同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。空间构象，从而对酶的催化活性产生影响。2.共价偶联法的优点、缺点共价偶联法的优点、缺点 （四）、交联法（四）、交联法 共价交联法的共价交联法的基本原理基本原理是酶分子和是酶分子和多功能试多功能试剂剂之间形成共价键得到三维的交联网状结构之间形成共价键得到三维的交联网状结构 1.1.共价交联法的四种形式：共价交联法的四种形式：（1）酶直接交联法：）酶直接交联法：在在酶液酶液中加入适量中加入适量多功能试剂多功能试剂，使其，使其形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试形成不溶性衍生物。固定化依赖于酶与试剂的浓度、溶液剂的浓度、溶液pHpH和离子强度、温度和反和离子强度、温度和反应时间之间的平衡。应时间之间的平衡。操作简单，但是缺乏选择性，活力回操作简单，但是缺乏选择性，活力回收往往不高。收往往不高。（2）酶辅助蛋白交联：）酶辅助蛋白交联：当可得到的酶量有限，可以使用第二个当可得到的酶量有限，可以使用第二个“载体载体”蛋白蛋白来增加蛋白质浓度，从而使来增加蛋白质浓度，从而使酶与惰性蛋白共交联的方法。酶与惰性蛋白共交联的方法。这种这种“载体载体”蛋白即辅助蛋白，可以是蛋白即辅助蛋白，可以是白蛋白、明胶、血红蛋白等。白蛋白、明胶、血红蛋白等。（4）载体交联法：）载体交联法：用用多功能试剂多功能试剂的一部分功能基团化学的一部分功能基团化学修饰高聚物修饰高聚物载体载体，而其中的另一部分功能，而其中的另一部分功能基团偶联基团偶联酶蛋白酶蛋白。（五）四种固定化酶制备方法的特点小结（五）四种固定化酶制备方法的特点小结制法制法特性特性三、酶催化反应器及其类型酶反应器：以酶为催化剂进行反应所需要的设备称之为酶催化反应器，简称酶反应器。酶反应器的类型：一类是直接用游离酶进行反应，即均相酶反应器另一类是应用固定化酶进行的非均相酶反应器。均相酶反应能在批量式搅拌桶反应器或超滤膜反应器中进行，而非均相酶反应则可在多种反应器中进行，适用于连续催化反应，包括连续流搅拌桶反应器、填充床反应器、流化床反应器、连续搅拌桶超滤和循环式反应器等。反应器的结构特点1.批量式搅 拌桶反应器批量式搅拌桶反应器又称为间歇式酶反应器、间歇式搅拌、搅拌式反应罐。间歇式反应器主要用于溶液酶反罐，即将酶与底物一起加入到反应器内，待达到规定的转化率后随即放料。在这种情况下，一般并不回收溶液酶。如果把固定化酶用于间歇反应器，则需把流出液中的固定化酶和产物分离，它可采用过滤或超滤法实现，回收的固定化酶可以反复多次使用。这类反应器结构简单，造价较低，传质阻力很小，反应能迅速达到稳态，主要应用在饮料等食品工业中。其缺点是操作麻烦，在反复回收过程中固定化酶容易损失，所以工业规模的固定 批量式搅拌桶反应器化酶很少采用。但是，常用于游离酶。三、固定化酶的性质固定化酶的性质 有一定的有一定的机械强度机械强度且稳定性好，催且稳定性好，催化剂与系统分相。化剂与系统分相。固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂固定化酶在使用前可充分洗涤，不带进杂质，在反应中质，在反应中酶与产物自然分开酶与产物自然分开，所以产物，所以产物易提纯，收率也高。易提纯，收率也高。酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提酶与细胞经过固定化以后，稳定性大为提高，可较长期使用与储藏，并可以高，可较长期使用与储藏，并可以再生再生。能能反复使用反复使用，可大大降低生产成本；同时可大大降低生产成本；同时也为实现生产的管道化、连续化与自动化提也为实现生产的管道化、连续化与自动化提供了可能。供了可能。四、固定化酶的应用四、固定化酶的应用固定化酶在工农业生产上的应用固定化酶在工农业生产上的应用 固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医药治疗上的应用 固定化酶在分析化学中的应用固定化酶在分析化学中的应用 固定化酶与基础理论固定化酶与基础理论 1.固定化酶在工农业生产上的应用固定化酶在工农业生产上的应用 生产流程生产流程含淀粉含淀粉的浆液的浆液-淀粉酶淀粉酶糊精糊精糖化酶糖化酶葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖异构酶异构酶葡萄糖的葡萄糖的异构化异构化42%42%45%45%转化成果糖转化成果糖果葡糖浆果葡糖浆果糖和葡果糖和葡萄糖分离萄糖分离葡萄糖再葡萄糖再次异构化次异构化反复多次反复多次果糖含量果糖含量70%70%90%90%高果糖浆高果糖浆固定化酶技术生产高果糖浆的图示：固定化酶技术生产高果糖浆的图示：反应柱能连续使用半年，大大反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高果糖的降低了生产成本，提高果糖的产量和质量。产量和质量。优点：优点：淀粉淀粉 糊精糊精葡萄糖葡萄糖 麦芽糖麦芽糖遇碘显蓝色遇碘显蓝色遇碘显红色遇碘显红色遇碘不显蓝色遇碘不显蓝色遇碘不显蓝色遇碘不显蓝色淀粉酶淀粉酶淀粉酶淀粉酶糖化淀粉酶糖化淀粉酶 淀粉淀粉 糊精糊精 石英砂石英砂 淀粉酶淀粉酶反应柱反应柱 分布着小分布着小孔的筛板孔的筛板 2.固定化酶在医药治疗上的应用固定化酶在医药治疗上的应用 溶液酶的应用缺陷：溶液酶的应用缺陷：酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶作为异体物质，在体内应用会导致免疫反应酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和酶是蛋白质，在体内易被网状内皮系统移除和被蛋白质酶水解破坏被蛋白质酶水解破坏由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织由于稀释效应，药物酶无法集中于靶器官组织以达到治疗所需的最适高浓度以达到治疗所需的最适高浓度 转入体内发挥作用（口服和注入）转入体内发挥作用（口服和注入）口服：口服：最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服最初主要限于消化酶类，近年来也有人尝试将酶以口服方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸方式用于尿中毒等疾患的治疗。口服的优点是药物通过粘膜吸收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。收后能迅速进行扩散，进入体内，通常不会引起免疫反应。注入：注入：是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方是最有实用价值的一种方式，溶液酶的弱点集中于此方式。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋式。固定化酶可很好的地解决这一问题，办法是将药物酶包埋于半透膜中，可容许小分子底物自由出入包埋膜，而药物酶和于半透膜中，可容许小分子底物自由出入包埋膜，而药物酶和破坏它的蛋白水解酶以及其他免疫因子等不会直接接触，因而破坏它的蛋白水解酶以及其他免疫因子等不会直接接触，因而可延长酶在体内的半寿期和避免免疫过敏反应。如果选择载体可延长酶在体内的半寿期和避免免疫过敏反应。如果选择载体适宜，或者在载体上偶联适当成分，还可使药物酶比较集中的适宜，或者在载体上偶联适当成分，还可使药物酶比较集中的送到靶细胞。送到靶细胞。通过通过“体外循环体外循环”做成人工脏器做成人工脏器 固定化酶也可做成固定化酶也可做成“人工脏器人工脏器”参与体外循参与体外循环，环，应用有两方面：应用有两方面：用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢用于除去有害的毒性物质及有潜在毒害作用的代谢产物产物除去氨基酸，使需要这些物质的病变组织除去氨基酸，使需要这些物质的病变组织“饿死饿死”；治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定；治疗时只需将患者的血液引出体外，通过由固定化酶等构成的化酶等构成的“人工脏器人工脏器”加以处理，然后再回流加以处理，然后再回流体内。体内。包埋药用酶的载体包埋药用酶的载体可溶性载体可溶性载体聚乙烯吡咯酮烷聚乙烯吡咯酮烷多糖或糖肽多糖或糖肽聚乙二醇聚乙二醇聚氨基酸以及血清白蛋白聚氨基酸以及血清白蛋白其他（核酸和脂类物质等）其他（核酸和脂类物质等）不可溶性载体不可溶性载体半透性聚合酶半透性聚合酶脂质体脂质体红血球血影细胞红血球血影细胞 3.固定化酶在分析化学中的应用固定化酶在分析化学中的应用 固定化酶在生化分析和临床检验中的应用也是一个十固定化酶在生化分析和临床检验中的应用也是一个十分重要的领域，它的发展非常迅速，这不仅因为它们分重要的领域，它的发展非常迅速，这不仅因为它们比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化等，比较稳定，可反复使用，能实行自动化、连续化等，而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，因此可而且因为它们对抑制剂和活化剂比较不敏感，因此可用于较复杂体系的检测。用于较复杂体系的检测。分析化验中应用的固定化酶大体分为两类：分析化验中应用的固定化酶大体分为两类：酶传感器酶传感器(酶电极酶电极)固定化酶柱检测器固定化酶柱检测器,包括固定化酶柱和检测器包括固定化酶柱和检测器 4.固定化酶与基础理论固定化酶与基础理论 1 1、用固定化酶、用固定化酶研究亚基间关研究亚基间关系：系：在适宜的条件下在适宜的条件下将寡聚体酶的一将寡聚体酶的一个亚基和载体偶个亚基和载体偶联固定联固定变性并除去其他变性并除去其他亚基亚基复性及活性检测复性及活性检测亚基重组和酶性亚基重组和酶性质的测定质的测定 2 2、应用固定化双酶或多酶系统进行模、应用固定化双酶或多酶系统进行模 拟试验能获得一些有意义的结果拟试验能获得一些有意义的结果将己糖激酶和葡萄糖将己糖激酶和葡萄糖-6-6-磷酸脱氢酶固定化在一起，磷酸脱氢酶固定化在一起，结果观察到偶联反应的初速度显著升高，而中间产物结果观察到偶联反应的初速度显著升高，而中间产物积累达到恒态水平所需的潜伏期大大缩短甚至消失。积累达到恒态水平所需的潜伏期大大缩短甚至消失。将上述两种酶和将上述两种酶和ATPATP再生系统同固定于白蛋白上，然再生系统同固定于白蛋白上，然后用能透过葡萄糖、但不能透过葡萄糖后用能透过葡萄糖、但不能透过葡萄糖-6-6-磷酸的膜磷酸的膜进行包埋，结果，在体外实现了进行包埋，结果，在体外实现了“反抗反抗”浓度梯度的浓度梯度的葡萄糖的葡萄糖的“活性运转活性运转”。3 3、通过固定化技术来改变酶的特性是酶分子修饰、通过固定化技术来改变酶的特性是酶分子修饰 模拟的一个方面内容。模拟的一个方面内容。第三章就 到这里了！