乙肝血清标志物检测ppt课件.ppt

乙肝血清学标志物检测及意义 山西医科大学第二医院检验科郭先锋1.要点n 简介n 抗原组成n 传染源n 传播途径n 病原学诊断n 血清学模式及临床意义End2.前 言n 病毒性肝炎在我国各类传染病中发病率最高n 乙型病毒性肝炎在我国危害极大n 我国乙型肝炎患者近3 千万n 病毒性肝炎，一般特指由嗜肝病毒感染所引起的肝炎。n HBV-属嗜肝DNA 病毒3.A病毒性肝炎Hepatitis Virus肠道传播肠道外传播F,TTV?其它ENANBNANBBDC病毒性肝炎-背景4.传染源粪便血液/血源性物质/体液血液/血源性物质/体液血液/血源性物质/体液粪便传播途径粪-口经皮肤/经粘膜经皮肤/经粘膜经皮肤/经粘膜粪-口慢性感染 否 是 是 是 否病毒性肝炎类型A B C D E基因组类型 ssRNA dsDNA ssRNA ssRNA ssRNA5.Hepatitis B Virusn 乙型肝炎的病原体n 乙型病毒性肝炎1是由乙肝病毒（HBV）引起的、以肝脏炎性病变为主并可引起多器官损害的一种传染病。本病广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年，少数患者可转化为肝硬化或肝癌。因此，它已成为严重威胁人类健康的世界性疾病，也是我国当前流行最为广泛、危害性最严重的一种传染病。6.n 乙型病毒性肝炎无一定的流行期，一年四季均可发 病，但多属散发。近年来乙肝发病率呈明显增高趋势估计全球半数以上人口已被HBV 感染过，5%的人口为HBV 慢性感染.n 中国：乙肝高发区，人群HBsAg 的检出率达9.8%7.电镜下Hepatitis B Virus8.乙型肝炎病毒HBVn 乙型肝炎病毒（HBV）为专一的嗜肝病毒，近年由于核酸分子杂交技术的进展，在肝外器官细胞也能检出HBV-DNA。通过北京乙肝肝病毒试验研究提供了在肝外细胞复制的证据。人HBV 也可能在肝外细胞内复制，有待深入研究。HBV 感染者血清经电镜检查有3 种病毒颗粒.n 1.大球形颗粒，完整的HBV 颗粒直径为42nm，又名Dane 颗粒，分为包膜与核心的两部分，外衣壳及包膜含有表面抗原，衣壳内为核心结构，有核心抗原，核心抗原下面藏有e 抗原。9.乙型肝炎病毒HBVn.小球形颗粒，阳性血清中最多的颗粒，主要为表面抗原，不含核酸及成分，为不完整的n.管形颗粒，实际上是一串小球形颗粒聚合在一起的，也含有表面抗原10.1.HBV形态结构大球形颗粒（Dane 颗粒）小球形颗粒管形颗粒11.HBV virionThe infectious virion is called the DANE particle.12.Dane 颗粒（完整的病毒）形态HBsAgHBcAgHBV DNADNAP（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）13.Both comprised of HBsAg14.HBV nomenclaturen HBV:hepatitis B virusn HBsAg:hepatitis B virus surface antigenn HBsAb:hepatitis B virus surface antibodyn HBcAg:hepatitis B virus core antigenn HBcAb:hepatitis B virus core antibodyn HBeAg:hepatitis B virus e antigenn HBeAb:hepatitis B virus e antibody15.抗原组成(一)-HBsAgn 位于病毒表面，是一种糖蛋白(曾用名：澳抗)n 出现时间：HBV感染后2 6 个月（潜伏期）n HBsAg 有10 个亚型，各亚型间存在不完全的交叉免疫。近年用亚型单克隆抗体研究表明，d和y、w 和r 决定簇可以同时存在于同一病毒抗原颗粒上，形成adwr、aywr、adyw 和adyr 复合亚型。16.n 其机制为不同亚型病毒的双重感染；单一亚型病毒感染后，有的HBV-DNA 发生点突变。临床表现病情反复，肝脏损害较重，因而有的HBV 感染者血清中同时HBsAg 阳性、抗-HBs 阳性。4 种亚型(adr,adw,ayr,ayw)。刺激机体产生保护性抗体即抗-HBs.17.HBsAg 血清中HBsAg 阳性是HBV 感染的标志。本身具有抗原性，无传染性。但由于HBsAg 常与HBV 同时存在，故认为是传染性标志之一。但须注意，HBV-DNA 可自X基因区终点起逆向与肝细胞发生整合，整合后的S 基因表达较强，不断产生HBsAg，整合的HBcAg 基因组被抑制，不表达HBeAg、HBcAg，在这种情况下，即使HBV已从体内清除，而HBsAg 仍可持续阳性，从理论上讲，这种HBsAg 阳性血液并无传染性。18.急性HBV 感染后，血清中首先出现HBsAg，整个急性期均可阳性，至恢复期可滴度下降或转阴。如HBsAg 持续阳性半年以上，称为慢性HBsAg 携带者（无症状HBsAg 携带者），可持续阳性达数年。一般认为HBsAg 滴度与病变程度不成比例。肝功能正常，HBsAg 滴度高，肝脏可重要病变，若HBsAg 阴性及DNAp 阴性，表示无重要传染性。反之，肝功能异常，HBsAg 滴度不高，肝脏可有明显病变，如有部分肝硬化、肝癌患者呈HBsAg 阴性或低滴度。无症状HBsAg 携带者或慢性活动性乙型肝炎均可有相同的HBsAg 滴度变化不能代表病情的轻重，因此分解此不能将HBsAg 滴度的变化作为判断病情轻重和药物治疗效的指标。19.n 用免疫电镜及免疫荧光法在肝细胞浆内证实有HBsAg,而血清中HBsAg 阴性，其机制尚无确切解释。已知原因之一是现用的RIA 检测法，其测试灵敏度为10-5,尚不能测出最低感染量(10-7)，因此有10%假阴性，故对HBsAg 的判断，以阳性有诊断意义，阴性不能排除HBV 感染。近年发现血清中HBV 标志均阴性，而在白细胞或肝细胞内检出HBV-DNA，说明确定或除外HBV 感染不能单凭HBsAg 是否阳性，应与其他标志结合判断。20.HBsAgn 持续时间 急性自限性肝炎：血中HbsAg 大多可持续1-6 周，最长可达6 个月内可消失 慢性肝炎或慢性HBsAg 携带者：可持续阳性。21.抗原组成(二)-HBcAgn HBcAg 为HBC 复制指标.位于Dane 颗粒核心部分和肝细胞核内，在血清中不易检出游离的HBcAgn 主要成分是蛋白质n 刺激机体产生抗-HBc(非保护性抗体)n 存在于受感染的肝细胞核内，有很强的免疫原性，在乙肝急性期、恢复期和HBsAg 携带者中常可检出抗-HBc。除非HBV C 基因序列出现极少数变异或感染者有免疫缺陷。n 抗-HBc IgM 阳性提示急性期或慢性感染急性发作，抗HBc IgG 出现较迟，但可保持多年或者终生。22.（抗-HBs 出 现 时 间：急 性 感 染 后 期 或HBsAg 转 阴 后（数 月 才 能 检 测 出）.6-12 月 内 逐 步 上 升 至 高峰，可持续多年，但滴度会逐渐下降。抗-HBs为 保 护 性 抗 体（中 和 抗 体）其 出 现标志着HBV感染进入恢复期-HBs 对 相 同HBsAg亚 型 的HBV再 感 染 有 免 疫力，但对不同亚型的HBV保护力不完全。23.抗原组成(三)-HBeAgn 位于HBV 的核心,是一种可溶性蛋白抗原n HBeAg 和Dane 颗 粒 出 现 相 平 行，且 与DNA 多 聚 酶 在 血 中 的消长动态相符合n 血 中HBeAg 的 出 现 可 作 为HBV 复 制 及 血 清 有 感 染 性 的 指 标.急 性HBV 感 染 时HBeAg 的 出 现 时 间 略 晚 于HBsAg，在 病 变极 期 后 消 失，如 果HbeAg 持 续 存 在 预 示 趋 向 慢 性。大 部 分情况持续存在表示患者处于高感染低应答期。n 刺 激 机 体 产 生 抗-HBe。转 换 过 程 意 味 着 由 免 疫 耐 受 转 换 为免疫激活，此时常有病变活动的激化。n 抗-HBe 能 与 受 染 肝 细 胞 表 面 的e 抗 原 结 合,通 过 补 体 介 导 破坏 受 染 的 肝 细 胞,抗-HBe 的 出 现 是 预 后 良 好 的 征 象。抗HBe阳 转 后，病 毒 复 制 处 于 静 止 状 态，传 染 性 降 低。部 分 病 人仍有病毒复制，肝炎活动，称为HBeAg 阴性慢性肝炎。24.HBV DNA是病毒复制和有传染性最直接的证据检 测 方 法：斑 点 杂 交 法、PCR 法 近 年 用 多 聚 酶 链 反应（PCR）这 一 体 外DNA 扩 增 技 术，使 灵 敏 度 提 高100 倍 以 上（10FGfg/ml），可 测 出 极 微 量 的 病 毒。HBV-DNA-p 是HBV 核 心 所 具 有 的DNA-p，在 病 毒 复 制过 程 中 起 逆 转 酶 作 用。DNA-p 活 性 是 表 示HBV 复 缺 点活 力 的 重 要 指 标。HBV-DNA 及DNA-p 检 测 有 助 于 判断HBV 感 染 者 病 毒 复 制 程 度 及 传 染 性 大 小，较 灵 敏评价抗病毒药物的疗效。乙 肝25.抗原组成(四)-Pre-S抗原n 位于HBV 的外衣壳上，有两种n 刺 激 机 体 产 生 抗Pre-S1和 抗Pre-S2，能 阻 断HBV 与 肝 细 胞 受 体 结 合，从 而起到抵抗病毒的作用n 抗Pre-S1和 抗Pre-S2的 出 现，表 示 病情好转，趋向痊愈26.传染源n 患者n 潜伏期n 急性期n 慢性期n 无症状HBsAg 携带者27.高 中等 低/不能检出血液 精液 尿血清 阴道分泌物粪便伤口渗出物唾液汗液泪液乳汁各种体液中HBV 的浓度28.血源性传播 输血、注射、外科和牙科手术、针刺等 剃刀、牙刷和蚊虫叮咬等 母婴垂直传播 宫内传播 分娩时微小皮损处传播 产后母婴密切接触 性传播HBV 传播途径29.30.病原学诊断(一)-抗原抗体检测n 项目：HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc 以及抗-HBc IgMn 方法n ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay，最常用，定性)n 发光免疫分析(定量)n 反相间接血凝试验(少用)31.ELISA 的基本原理n 利用抗原和抗体特异性结合n 主要的试剂n 固相抗原或抗体n 酶标记的抗原或抗体n 酶的底物32.ELISA 的主要方法n 间接法:测定抗-HBsn 夹心法：测定HBsAg 和HBeAgn 竞争法：测定抗-HBcn 中和法：测定抗-HBen 捕捉法：测定抗-HBc IgM33.病原学诊断(二)核酸检测n 核酸杂交n 探针n PCRn 引物34.各项HBV 血清标志物的解释n HBsAg HBV 感染的标志,可能是急性或慢性n Anti-HBs 既往感染自然免疫/接种疫苗产生n Anti-HBc IgM 急性HBV 感染标志n Anti-HBc IgG 既往或慢性HBV 感染n HBeAg 病毒复制活跃，具有高度传染性n Anti-HBe 慢性感染,病毒不再复制,低传染性n HBV-DNA 直 接 测 定 病 毒 复 制 状 态，比HBeAg 更准确；临床主要用于监测治疗反应35.为什么要开展乙肝“两对半”定量检测n 乙型病毒性肝炎是世界性的传染病，严重地威胁着人类的健康。我国是乙型病毒性肝炎高发病国家。据统计全世界无症状携带者（HBsAg 携带者）超过2.8 亿，我国占1 亿以上，且多数无症状。所以乙肝的早期诊断对控制传染源、降低发病率及疾病的治疗均具有很重要的意义。酶标（ELISA）检测始于20 世纪80 年代中期，它对乙肝“两对半”定性测定在疾病的诊断，病情监测，疗效观察起到了一定的作用，但酶标检测HbsAg 灵敏度较低，不能真正意义上定量测定血清中HbsAg 含量。随着临床医学的发展，定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求。化学发光免疫分析定量测定乙肝“两对半”大大弥补了酶标定性测定及灵敏度低的不足。36.血清学检测的临床意义HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义 急性或慢性感染(大三阳)+-+-+乙肝后期或慢性感染(小三阳)-+-潜伏期或急性乙肝早期-+痊愈或恢复期,有免疫力-+-痊愈,有免疫力疫苗接种或曾经感染过,有免疫力37.血清学检测的临床意义 HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义血清学检测的临床意义 血清学检测的临床意义 急性或慢性感染(传染性弱)+-+-+急性乙肝恢复期或既往感染-+急性窗口期或既往感染康复期-未感染过 HBV+-+-+急性感染趋向恢复;慢性携带者HBV感染已恢复,有免疫力38.SymptomsHBeAganti-HBeTotal anti-HBcIgM anti-HBcanti-HBsHBsAg0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 100Acute HBV Infection with RecoveryTypical Serologic CourseWeeks after ExposureTitre39.IgM anti-HBcTotal anti-HBcHBsAgAcute(6 months)HBeAgChronic(Years)anti-HBe0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52YearsWeeks after ExposureTitreProgression to Chronic HBV InfectionTypical Serologic Course小结40.乙肝五项检测的影响因素n 1.样本采集与处理的影响1.1 标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。1.2 塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD 值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA 系统中辣根过氧化物酶活性。1.3 标本凝固不全，正常血液采集后1/22h 开始凝固，1824h 血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。41.乙肝五项检测的影响因素n 2、试剂的影响2.1 乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，有资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%99.3%,7889%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。2.2 不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA 检测HBsAg 结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。42.乙肝五项检测的影响因素n 3、干扰物质的影响有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig 抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF 因子可与标记二抗的FC 段法结合造成假阳性，补体从C1q 活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc 的C1q 分子结合点暴露出来，则补体C1q 可将二者连接起来造成假阳性，采用56 30 分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。43.乙肝五项检测的影响因素n 4、药物的影响4.1 高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出，所以一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的出现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射乙肝免疫球蛋白，不仅影响孕妇HBsAg的检出；而且其所生产的生新儿也常出现HBsAg阴性，HBeAg 阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5ML的盐酸处理标本1小时可提高出率。4.2 为预防乙肝，部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的12周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.，有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。44.乙肝DNA 检测的临床意义n HBV-DNA称为乙肝病毒脱氧核糖核酸。乙肝病毒是一种部分双链DNA病毒，也就是说它的遗传物质是DNA，它载有病毒所有遗传信息，乙肝病毒靠它才可以复制、增殖、繁衍后代。研究证明，乙肝病毒的裸DNA(没有蛋白质包裹DNA)就有感染性，完成对宿主的侵袭，造成宿主体内出现完整的乙肝病毒颗粒。也就是说HBV-DNA相当于完整的乙肝病毒颗粒。因此，检测HBV-DNA是判断乙肝病毒有无复制的“金指标”。DNA的检测的目的主要是判断目前患者病毒复制程度的大小，也是传染性大小，尤其在判断乙肝的转归，以及用药前后的疗效的判断有很重要的作用，也是重要的用药指征之一，尤其是抗病毒治疗。现在这种基因的检测技术已经广泛的应用于临床。45.应采取以疫苗接种和切断传播途径为重点的综合性措施。一.乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白（HBIG）的应用在目前HBsAg 携带者广泛存在，传染源管理十分困难的情况下，控制和预防乙型肝炎，关键性措施是用乙肝疫苗预防。我国已将乙肝疫苗接种纳入计划免疫，此外下列人群亦为乙肝疫苗接种的适应症：HBsAg 阳性，特别是HBeAg 同时阳性母亲所生的新生儿；乙肝高发区3 岁以下幼儿；医务人员，接触血液的人员；多次接受输血及血制品的患者；HBsAg阳性者家庭成员，尤其是配偶，凡是患有急性或慢性疾病或对福尔马林和抑菌剂硫柳汞过敏者禁用。预 防46.HBsAg 阳性孕妇的新生儿用30g 免疫3 针；HBsAg 阴性孕妇的新生儿第1 针为30g，第2、3 针各为 10g；高危人群，如肾透析患者和其他职业性与乙肝密切接触者 用20g 免疫3 针；其他一般易感人群（包括儿童、成人）10g 免疫3 针。以 上均按0、1、6 月免疫程序，但新生儿第1 针应在出生后24 小时内接种，免疫效果更好。也有用0、1、2 月免疫程序者。目前多主张对高危人群（尤其HBsAg 阳性，同时HBcAg 阳性孕妇的新生儿；接种乙肝疫苗因人而异我国应用的免疫剂量和程序47.意外受HBV 感染，如被HBsAg 阳性血液污染的针头刺伤 或被HBsAg 阳性血液溅入眼结膜或口腔粘膜或输入HBsAg阳性血液、手术刀损伤皮肤等），一般应立即（24 小时之内）肌肉注射乙肝免疫球蛋白。如HBIG 每毫升含抗-HBs200IU 以上者可注射0.5 0.7ml/kg。48.49.欢迎指正50.