大鼠血管平滑肌细胞的培养课件.ppt

大鼠血管平滑肌细胞的培养细胞培养方法1.组织块培养法2.消化培养法3.器官培养法w将组织剪成小块后接种于培养瓶特点：简便易行、成功率较高。细胞培养方法w组织块培养法w消化培养法w器官培养法细胞培养方法w组织块培养法w消化培养法w器官培养法w从供体取得器官或器官组织块后，不进行组织分离而直接在一定环境中培养，保持其原有器官细胞的结构和联系并生存。体外培养细胞的分型1.贴附型:细胞贴附在支持物上生长2.悬浮型：不贴附于支持物，呈悬浮生长“无菌”细胞培养实验室1.无菌操作区（无菌操作室、超净台）2.孵育区3.制备区4.储藏区5.清洗和消毒灭菌区w将 CaCl2先溶解在100mL的ddH2O中，其它成分溶在750 mL的ddH2O中，混匀（用磁力搅拌器搅拌至溶解），定容至1000mL。高压蒸气消毒10分钟，4冰箱保存。w将以上成分溶于900mL ddH2O中，充分混匀，加ddH2O至1000 mL。高压蒸气消毒10分钟，4冰箱保存。青霉素、链霉素液配制w青霉素80万U加Hanks液至80 mL，终浓度1万u/mLw链霉素100万U（相当于1g）加Hanks液至100 mL，终浓度10mg/mLw分装后至-20冰箱保存。小牛、胎牛血清灭活w55水浴箱30分钟，置4冰箱保存w灭活前放于-20冰箱保存待用w临用前加入DMEM液中 平滑肌细胞原代培养方法 w动物：大鼠150180g，23只操作步骤w大鼠颈椎脱臼致死w固定w消毒胸腹部w大组织镊、组织剪切开胸腹部皮肤w另一组织镊、组织剪切开胸腹部，并切除部分胸壁以利暴露w眼科镊和眼科弯剪分离胸腹主动脉并放入盛有Hanks液的细胞培养皿中，转入无菌室。或先用生理盐水漂洗，再放Hanks液中，转入无菌室 w眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层。w放入另一盛有Hanks液的细胞培养皿中，剪去血管外的小分支w用吸管把组织块转入玻璃培养皿中，均匀贴壁，组织块的间距为0.5cmw盖好瓶盖，轻轻翻转培养瓶，让瓶底朝上，并向瓶内注入适量培养液，于37C孵箱内放置45小时，使得组织块干涸，并与瓶底贴附w将培养瓶慢慢翻转平放，使组织块完全浸入培养液中，继续静置35天，切勿移动。待有细胞从组织块周围游离出后换液平滑肌细胞传代w传代时间：大部分组织块长出细胞晕，并与相邻细胞晕相接触时就可以传代注意：w初次传代对胰酶敏感，加入消化液30s，即消化充分，以后2分钟左右w细胞消化完成后，用吸管反复抽吸打散细胞w中止消化：加入DMEM培养液3滴管，用吸管反复吹打瓶壁细胞w离心：1500 X5分钟w倒掉液体，加D-Hanks液洗一次，再加10mL DMEM培养液，用吸管抽吸吹打分散细胞，分装于2个培养瓶。在倒置纤微镜下可见圆形细胞。放入细胞培养箱中培养培养细胞的鉴定1、形态学鉴定：用相差显微镜常规观察细胞生长形态以及生长规律。并依据常规制作电镜标本进行观察 电镜观察结果：细胞形态不规则，胞浆内有肌丝，纵向排列，有密区，具备平滑肌细胞特征2、免疫组织化学鉴定：特异性鼠抗平滑肌肌动蛋白单克隆抗体，采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色免疫组织化学鉴定结果：镜下观察到细胞爬片，可见细胞浆内大量平行阳性染色胞核不着色。所有细胞染色，结果均为阳性