蛋白质体外表达技术蛋白质相互作用研究方法课件.ppt

蛋白质体外表达技术蛋白质体外表达技术蛋白质相互作用研究方法蛋白质相互作用研究方法2012.11.302012.11.302蛋白质体外表达技术3生物学研究生物学研究-基因功能基因功能4蛋白蛋白质的表达的表达6基因功能基因功能蛋白功能？蛋白功能？基基 因因蛋蛋 白白功 能遗传信息遗传信息遗传信息遗传信息多样多样多样多样结 构单一单一单一单一复杂、修饰多复杂、修饰多复杂、修饰多复杂、修饰多获 取容易容易容易容易较难较难较难较难技 术较成熟较成熟较成熟较成熟、稳定稳定稳定稳定操作简单操作简单操作简单操作简单种类多、较复杂种类多、较复杂种类多、较复杂种类多、较复杂易变性易变性易变性易变性研究内容简单简单简单简单具体分析具体分析具体分析具体分析7蛋白功能？蛋白功能？蛋白质体外表达技术蛋白质体外表达技术in vivo protein expressionin vitro（cell-free）protein expressionchemical protein synthesis原核生物、真核生物原核生物、真核生物酶、辅助因子等酶、辅助因子等8合成多肽链合成多肽链优优 点点缺缺 点点原原 核核菌体生长快菌体生长快产量高产量高应用广泛应用广泛无法修饰无法修饰无法折叠无法折叠易形成包涵体易形成包涵体不能表达毒性蛋白不能表达毒性蛋白真真 核核可修饰、折叠可修饰、折叠产量低产量低费时费时不能表达毒性蛋白不能表达毒性蛋白10优优 点点缺缺 点点cell free快快 速速避免蛋白酶作用避免蛋白酶作用氨基酸可控制氨基酸可控制产量低产量低chemical synthesis氨基酸可控制氨基酸可控制纯度高纯度高费用高费用高只适合短肽只适合短肽产量低产量低活性难以保证活性难以保证cell-free protein expressionchemical protein synthesis11 原核生物：原核生物：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 真核生物：真核生物：酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞in vivo protein expression13原原 核核 表表 达达protein expression in E.Coli.15基因克隆基因克隆细胞细胞表达载体表达载体表达条件表达条件step-1step-2step-3step-416step-2 表达载体表达载体融合标签融合标签（fusion tag）HIS、FLAG、HA、Myc、GST、MBP标签是否去除标签是否去除限制性内切酶位点限制性内切酶位点18融合标签的作用融合标签的作用 检测和纯化目的蛋白检测和纯化目的蛋白 增加目的蛋白的可溶性增加目的蛋白的可溶性 有助于目的蛋白的定位，提高其生物活性有助于目的蛋白的定位，提高其生物活性HIS、FLAG、HA、Myc、GST、MBP19功能最强大、应用最广泛功能最强大、应用最广泛 pET3,pET5,pET9，pET28，pET30，pET34.等等35种载体种载体pET载体系列载体系列Novagen公司公司20 基础表达水平最低 提供各种不同融合标签 二硫键形成、蛋白外运等专用载体pET载体系列的特点载体系列的特点pET载体载体原核蛋白表达引用最多的系统原核蛋白表达引用最多的系统210.25mM IPTG,28 诱导诱导22step-3 菌株菌株菌株：BL21(DE3)Rosetta 可增强带有大肠杆菌稀有密码子 的真核蛋白的表达2425LysGlu密码子的偏好性同义密码子的使用频率同义密码子的使用频率？26step-4 表达条件表达条件目的蛋白能否表达？目的蛋白能否表达？诱导条件、载体、标签、菌株诱导条件、载体、标签、菌株目的蛋白是否可溶？目的蛋白是否可溶？诱导物浓度、温度、标签诱导物浓度、温度、标签28小量诱导小量诱导 IPTG：0.1-1mM 温度温度:18-37 上清、包涵体上清、包涵体 Western鉴定鉴定29原核表达蛋白的用途原核表达蛋白的用途体外研究：体外研究：蛋白质的活性分析蛋白质的活性分析 蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用制备抗原：制备抗原：制备抗体制备抗体结晶：结晶：用于蛋白质结构的研究用于蛋白质结构的研究3132蛋白质相互作用研究方法蛋白质之间的相互作用蛋白质之间的相互作用酵母双杂交酵母双杂交COIP（CO-ImmunoPrecipitation）Pull down33酵母双酵母双杂交交3435ImmunoPrecipitation36ImmunoPrecipitation3738CoIP（Co-ImmunoPrecipitation）HISFLAGHAMycGSTMBP39原核表达蛋白原核表达蛋白40 Pull down41 Pull down42 Pull down43