sp04第四章微生物的遗传变异和育种3--第三节--基因重组和杂交育种-食品微生物学课件.ppt

山东农业大学生命科学学院第三节第三节基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种基因重组（基因重组（基因重组（基因重组（generecombinationgenerecombination）：凡把两个不同性状的个凡把两个不同性状的个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。杂交（杂交（杂交（杂交（hybridizationhybridization）：）：）：）：细胞水平上的基因重组。包含了分子细胞水平上的基因重组。包含了分子水平上的重组，例如真核微生物中的有性杂交、准性杂交、水平上的重组，例如真核微生物中的有性杂交、准性杂交、原生质体融合，以及原核生物中的转化、转导、接合和原原生质体融合，以及原核生物中的转化、转导、接合和原生质体融合。生质体融合。基因重组是杂交育种的理论基础。基因重组是杂交育种的理论基础。由于由于杂交育种是选用已知性杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本状的供体和受体菌种作为亲本 ，因此不论在方向性还是自觉性方面，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步。都比诱变育种前进了一大步。微生物中各种形式基因重组的比较微生物中各种形式基因重组的比较微生物中各种形式基因重组的比较微生物中各种形式基因重组的比较 重组范围重组范围供体和受体的关系供体和受体的关系整整套套染染色色体体局局部部杂杂合合高频率高频率低频率低频率部分染色体部分染色体个别或少数个别或少数基因基因细胞融合细胞融合或联结或联结性细胞性细胞真菌的有性真菌的有性生殖生殖体细胞体细胞真菌的准性真菌的准性生殖生殖细胞间暂时沟通细胞间暂时沟通细菌的结合细菌的结合性性导导细胞间细胞间不接触不接触吸收游离吸收游离DNA片段片段转转化化噬菌体携带噬菌体携带DNA转转导导由噬菌体提由噬菌体提供遗传物质供遗传物质完整噬菌体完整噬菌体溶源转变溶源转变噬菌体噬菌体DNA转转染染山东农业大学生命科学学院一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组原核生物基因重组的特点：原核生物基因重组的特点：片断性：一小段片断性：一小段DNA序列序列单向性：供体基因组单向性：供体基因组受体基因组受体基因组机制独特而多样：主要有机制独特而多样：主要有4种种四种主要的遗传重组形式：四种主要的遗传重组形式：转化、转导、接合、原生质体融合转化、转导、接合、原生质体融合山东农业大学生命科学学院（一）转化（一）转化（一）转化（一）转化（transformationtransformation）1.转化：转化：受体菌直接吸收了来自供体菌的受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，从而获得部分供体菌遗传性状的现把它整合到自己的基因组中，从而获得部分供体菌遗传性状的现象。象。转化子转化子（transformant）：）：通过转化方式而形成的杂种后代。通过转化方式而形成的杂种后代。1928年，年，Griffith发现肺炎链球菌（发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的转化现象的转化现象目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力进行转化的条件：进行转化的条件：感受态的受体细胞感受态的受体细胞外源游离外源游离DNA分子分子山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院3.3.影响转化的因素：影响转化的因素：（1 1）两个菌种或菌株的亲缘关系）两个菌种或菌株的亲缘关系（2 2）受体细胞必须处于感受态：）受体细胞必须处于感受态：感受态：受体细胞最容易接受外源感受态：受体细胞最容易接受外源DNADNA片段并能实现转化的一种片段并能实现转化的一种生理状态生理状态影响感受态出现的因素影响感受态出现的因素培养时间：生长的对数期、稳定期培养时间：生长的对数期、稳定期群体比例和维持时间群体比例和维持时间外外界界环环境境因因子子：cAMPcAMP和和CaCa2+2+影影响响最最明明显显。cAMPcAMP可可使使嗜嗜血血杆杆菌菌的感受态水平提高的感受态水平提高10105 5倍。倍。感感受受态态的的调调节节：感感受受态态因因子子胞胞外外蛋蛋白白，可可以以催催化化外外来来 DNADNA片片段段的的吸吸收收或或降降解解细细胞胞表表面面某某种种成成分分。包包括括3 3种种主主要要成成分分：膜膜相关相关DNADNA接合蛋白、细胞壁自溶素、核酸酶。接合蛋白、细胞壁自溶素、核酸酶。山东农业大学生命科学学院4.转化因子转化因子离体的离体的DNA片断片断（1）转化因子的本质与类型）转化因子的本质与类型离体的离体的DNA片段（片段（15kb左右）左右）类型：类型：dsDNA、ssDNA和质粒和质粒DNA（通常不与核染色（通常不与核染色体发生重组）体发生重组）（2）转化的频率：）转化的频率：0.11.0，最高，最高20（3）转转 化化 的的 DNA的的 浓浓 度度：110-5ug/mL（110-11 ug/mL）山东农业大学生命科学学院5.转化微生物的种类：转化微生物的种类：原核生物：原核生物：Streptococcus pneumoniae,Bacillus sp.Rhizobium sp.Staphylococcus sp.Pseudomonas sp真核生物：真核生物：Saccharomyces cerevisiae Neurospora crassa Aspergillus niger 在实验室中的操作：在实验室中的操作：E.coli可以可以CaCl2处理成球状体；真处理成球状体；真菌制成原生质体。菌制成原生质体。山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院7.7.转染与转化的比较转染与转化的比较转转转转染染染染(transfection)(transfection)(transfection)(transfection)：用用提提纯纯的的病病毒毒核核酸酸去去感感染染其其宿宿主主细细胞胞或原生质体，可增值出一群正常病毒后代的现象。或原生质体，可增值出一群正常病毒后代的现象。与与与与转转转转化化化化的的的的区区区区别别别别：作作为为转转染染的的病病毒毒核核酸酸并并非非是是供供体体基基因因，中中间间不不发发生生遗遗传传因因子子的的交交换换和和整整合合，不不产产生生具具有有杂杂种种性性质质的的转化子。转化子。山东农业大学生命科学学院小总结小总结自然遗传转化的基本概念；自然遗传转化的基本概念；感受态；感受态；转化模型；转化模型；自然转化自然转化人工转化人工转化基因工程基因工程基因工程的奠基石和基础技术基因工程的奠基石和基础技术环境中发生的自然转化：环境中发生的自然转化：水平基因转移、生物进化水平基因转移、生物进化山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院利用转化绘制遗传图利用转化绘制遗传图（1）连锁检测）连锁检测：判断两个基因是否连锁，一个可靠的依据是观察判断两个基因是否连锁，一个可靠的依据是观察DNA浓浓度降低时的转化频率的改变。度降低时的转化频率的改变。（2）遗传图的绘制：）遗传图的绘制：受体所摄取的外源受体所摄取的外源DNA只是一个小片段，如果两个基因只是一个小片段，如果两个基因在染色体上相距较远，那么就不可能为同一片段在染色体上相距较远，那么就不可能为同一片段DNA所所携带；如果两个基因紧密连锁时，他们就有很大可能被同携带；如果两个基因紧密连锁时，他们就有很大可能被同一转化因子所携带，一同整合到受体细胞上，可通过两个一转化因子所携带，一同整合到受体细胞上，可通过两个紧密连锁紧密连锁 的基因共转化来绘制遗传图。的基因共转化来绘制遗传图。山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院（二）转导（二）转导（transduction）1951年，年，Joshua Lederberg和和Norton Zinder为了证实大肠杆菌为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验。养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验。用用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！情况下，同样出现原养型细菌！Why and How?沙门氏菌沙门氏菌LT22A是携带是携带P22噬菌体的溶源性细菌；另一株是非溶源性噬菌体的溶源性细菌；另一株是非溶源性细菌。基因的传递很可能是由可透过细菌。基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的型管滤板的P22噬菌体介噬菌体介导的导的一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！证！（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）山东农业大学生命科学学院1.转导：转导：通过缺陷噬菌体的通过缺陷噬菌体的媒介作用媒介作用，把供体细胞的，把供体细胞的DNA小片段携带到受体细胞中，通过交换和整合，从而使后者小片段携带到受体细胞中，通过交换和整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。获得前者部分遗传性状的现象。转导子（转导子（transducant）：获得新遗传性状的受体细胞。获得新遗传性状的受体细胞。2.转导的类型转导的类型2.1普遍转导：任何供体的染色体都可以转移至受体细胞。普遍转导：任何供体的染色体都可以转移至受体细胞。完全普遍转导、流产普遍转导完全普遍转导、流产普遍转导2.2局限转导：靠近染色体上溶源化位点的基因局限转导：靠近染色体上溶源化位点的基因DNA片段片段被转导。低频转导、高频转导被转导。低频转导、高频转导溶原转变溶原转变山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院2.1普遍转导（普遍转导（completetranduction）普遍转导：普遍转导：普遍转导：普遍转导：通过完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何通过完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何DNA小片段的小片段的“误包误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍转导。的转导现象，称为普遍转导。一般用温和噬菌体作为媒介。一般用温和噬菌体作为媒介。一般用温和噬菌体作为媒介。一般用温和噬菌体作为媒介。分为：分为：完全普遍转导；完全普遍转导；流产普遍转导。流产普遍转导。山东农业大学生命科学学院完全普遍转导完全普遍转导完全普遍转导完全普遍转导（complete transduction）：简称完全转导。由简称完全转导。由完全不含噬菌体自身完全不含噬菌体自身DNA的假噬菌体完全缺陷噬菌体把外源的假噬菌体完全缺陷噬菌体把外源DNA片段导入受体细胞内。片段导入受体细胞内。Salmonella typhimurium，P22Phage感染复数小于感染复数小于1 1交换、整合、复制等交换、整合、复制等山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院流产普遍转导：流产普遍转导：流产普遍转导：流产普遍转导：简称流产转导（简称流产转导（abortive transductionabortive transduction），），经经转导而获得了供体菌转导而获得了供体菌DNADNA片段的受体菌，如果外源片段的受体菌，如果外源DNADNA在其内既在其内既不不进行交换、整合和复制进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。性状表达，这种现象就称流产转导。山东农业大学生命科学学院2.2 2.2 局限转导（局限转导（specialized/restricted tranductionspecialized/restricted tranduction）（1 1）局限转导：通过）局限转导：通过部分缺陷部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。（2 2）进行局限转导的微生物：）进行局限转导的微生物：E.coliE.coli K12 K12 诱导产生的：诱导产生的：E.coliE.coli的的和和8080噬菌体噬菌体（3 3）转导的类型：）转导的类型：低频局限转导低频局限转导高频局限转导高频局限转导山东农业大学生命科学学院局限性转导局限性转导山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到不正常切离会将插入位点两侧之一的少数宿主基因连接到噬菌体噬菌体DNA上，就形成了一种特殊的噬菌体，即缺陷噬上，就形成了一种特殊的噬菌体，即缺陷噬菌体。菌体。由于宿主染色体上进行不正常切离的频率极低，因此所形由于宿主染色体上进行不正常切离的频率极低，因此所形成的裂解物中所含的噬菌体的比例极低成的裂解物中所含的噬菌体的比例极低低频转导低频转导（LFT）裂解物的形成裂解物的形成低频转导低频转导（LFT）裂裂解物去感染受体菌（低的感染复数）解物去感染受体菌（低的感染复数）形成局限转导子。形成局限转导子。山东农业大学生命科学学院高频转导（高频转导（HFT,High frequency transduction）高频转导：高频转导：高频转导：高频转导：营养缺陷菌体受到双重感染（正常噬菌体和缺陷营养缺陷菌体受到双重感染（正常噬菌体和缺陷噬菌体）后变为双重溶源菌，进行诱导后能产生噬菌体）后变为双重溶源菌，进行诱导后能产生50%左右左右的局限转导噬菌体的的局限转导噬菌体的HFT裂解物，用它对转导受体菌进行裂解物，用它对转导受体菌进行转导从而可获得转导从而可获得50%左右转导子的局限转导类型。左右转导子的局限转导类型。高频转导的过程：高频转导的过程：高频转导的过程：高频转导的过程：噬菌体感染供体菌；噬菌体感染供体菌；HFT Lysate制备；低感染复数感染受制备；低感染复数感染受体菌；整合到受体菌基因组体菌；整合到受体菌基因组如用HFT裂解物（dgal）去感染另一个营养缺陷菌体，会转变为原养型。E.Coil gal-E.Coil gal+山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院（4 4）局限转导特点：）局限转导特点：）局限转导特点：）局限转导特点：1 1）传递基因：只能转导供体菌的个别特定基因；）传递基因：只能转导供体菌的个别特定基因；2 2）携带载体：该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；）携带载体：该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；3 3）缺陷噬菌体形成方式：是由于其脱离宿主核染色体过程）缺陷噬菌体形成方式：是由于其脱离宿主核染色体过程中，发生低频率的误切或由于双重溶源菌的裂解而形成；中，发生低频率的误切或由于双重溶源菌的裂解而形成；4 4）局限转导噬菌体的形成：要通过）局限转导噬菌体的形成：要通过UVUV等因素对溶源菌的诱等因素对溶源菌的诱导并引起裂解后才产生。如：导并引起裂解后才产生。如：E.coliE.coli的的噬菌体和噬菌体和8080噬噬菌体。菌体。山东农业大学生命科学学院3.具有转导现象的微生物具有转导现象的微生物Salmonella typhimuriumE.coliBacillusProteusPseudomonasShigellaStaphylococcusVibrioRhizobium山东农业大学生命科学学院复习复习 溶源转变溶源转变（Lysogenic conversion）概念：当正常温和噬菌体感染其宿主细胞而使其发生溶源概念：当正常温和噬菌体感染其宿主细胞而使其发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主化时，因噬菌体基因整合到宿主的核基因组上，而使宿主获得了除免疫性之外的新遗传性状的现象。获得了除免疫性之外的新遗传性状的现象。与转导的本质区别：与转导的本质区别：1）不携带任何供体菌的外源基因，宿主新性状是由于噬菌不携带任何供体菌的外源基因，宿主新性状是由于噬菌体本身引起的；体本身引起的；2）这种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的；）这种温和噬菌体是完整的，而不是缺陷的；3）获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是经过遗传重）获得新性状的是溶源化的宿主细胞，而不是经过遗传重组形成的转导子；组形成的转导子；4）获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失。）获得的性状可随噬菌体的消失而同时消失。山东农业大学生命科学学院发生溶源转变的微生物（发生溶源转变的微生物（P229）Corynebacterium diphtheriae -温和噬菌体：不产毒素变为产毒素 Clostridium botulinum 新性状：产C或D型肉毒毒素 Salmonella anatum 15噬菌体细胞表面多糖结构 Streptomyces erythreus P4温和噬菌体：红霉素生物合成和形成气生菌丝能力山东农业大学生命科学学院（三）结合（三）结合（conjugation）通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。组过程。关键：在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细关键：在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移过程。胞向受体细胞转移过程。19461946年，年，Joshua Joshua LederbergLederberg 和和Edward Edward L.TaturmL.Taturm“细菌的细菌的多重营养缺陷型多重营养缺陷型杂交实验杂交实验”山东农业大学生命科学学院19461946年，年，LederbergLederberg和和TatumTatum在实验中成功地发现了细菌的接合现在实验中成功地发现了细菌的接合现象。他们用大肠杆菌象。他们用大肠杆菌K12K12的两个营养缺的两个营养缺陷型菌株混合培养。陷型菌株混合培养。山东农业大学生命科学学院山东农业大学生命科学学院结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组，但是必须要解结果可以解释为细菌接合以后发生基因重组，但是必须要解决的问题：决的问题：（1）转化作用的排除）转化作用的排除（2）F质粒的发现质粒的发现“U”型管实验（型管实验（BernardDavis，1950）重组子不是转化的结果重组子不是转化的结果需要两亲本的接触需要两亲本的接触山东农业大学生命科学学院F质粒结构及其在细胞中的存在质粒结构及其在细胞中的存在状态状态 F质粒的遗传结构：质粒的遗传结构：双链环状双链环状DNA分子，分子，DNA长度为长度为99159bp。F质粒的结构整个基因组由三个质粒的结构整个基因组由三个主要区段组成：主要区段组成：（1）转移区）转移区 （2）复制区）复制区 （3）插入区）插入区 F质粒在细胞内的存在形式质粒在细胞内的存在形式：四：四种类型：种类型：F-、F+、Hfr、F 99159bp复制复制区区插入区山东农业大学生命科学学院1.1.接合概念接合概念接合概念接合概念接合：接合：供体菌（供体菌（“雄雄”）通过其性菌毛与受体菌（）通过其性菌毛与受体菌（“雌雌”）相接触，相接触，把把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，递给后者，并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色并在后者细胞中进行双链化或进一步与核染色体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的体发生交换、整合，从而使后者获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。现象，称为接合。接合子（接合子（conjugant）：通过接合而获得新性状的受体细胞通过接合而获得新性状的受体细胞。也叫重组子（也叫重组子（recombinant）山东农业大学生命科学学院2.2.进行接合的微生物种类进行接合的微生物种类进行接合的微生物种类进行接合的微生物种类细菌和放线菌细菌和放线菌细菌，革兰氏阴性细菌 E.coli，Salmonella，Shigella，Klebsiella，Serratia，Vibrio，Azotobacter，Pseudomonas放线菌 Streptomyces，Nocardia等。最常见的S.coelicolor不同属间的接合 E.coli and Salmonella typhimurium Salmonella and Shigella dysenteriae山东农业大学生命科学学院3.3.E.coliE.coli的接合现象的接合现象的接合现象的接合现象E.coli性别决定质粒性别决定质粒F质粒质粒什么是什么是F质粒？质粒？决定大肠杆菌决定大肠杆菌E.coli性别分化的质粒，是一性别分化的质粒，是一种属于附加体性质的质粒，既可在细胞中单独存在，也种属于附加体性质的质粒，既可在细胞中单独存在，也可整合到核染色体组上。可整合到核染色体组上。通过接合而获得；通过吖啶化合物、溴化乙锭或丝裂霉通过接合而获得；通过吖啶化合物、溴化乙锭或丝裂霉素等处理而发生质粒消除（抑制素等处理而发生质粒消除（抑制F质粒的复制）。质粒的复制）。合成性菌毛基因的载体合成性菌毛基因的载体决定细菌性别的物质基础决定细菌性别的物质基础山东农业大学生命科学学院四种接合型四种接合型四种接合型四种接合型E.coliE.coli菌株（菌株（菌株（菌株（F F质粒在细胞内存在方式）质粒在细胞内存在方式）质粒在细胞内存在方式）质粒在细胞内存在方式）F+（“雄性雄性”）菌株：含有）菌株：含有F因子，有性菌毛。因子，有性菌毛。F-（“雌性雌性”）菌株：不含有）菌株：不含有F 因子，无有性菌毛。因子，无有性菌毛。Hfr菌株（菌株（high frequency recombination strain）：F质粒从游离质粒从游离态转变成核染色体特定位点上的整合态。因为态转变成核染色体特定位点上的整合态。因为Hfr菌株与菌株与F-菌株菌株接合后发生重组的频率要比接合后发生重组的频率要比F+与与F-接合后的重组频率高出数百接合后的重组频率高出数百倍，故名高频重组菌株。倍，故名高频重组菌株。F 菌株：当菌株：当Hfr菌株内的因子因不正常切离而脱离核染色体组菌株内的因子因不正常切离而脱离核染色体组时，可重新形成游离的但携带一小段染色体基因的特殊因子，时，可重新形成游离的但携带一小段染色体基因的特殊因子，称称F因子。因子。初生初生F菌株：菌株：携带携带F 因子的菌株，其遗传性状介于因子的菌株，其遗传性状介于F+与与Hfr之间。之间。次生次生F 菌株：菌株：通过通过F 菌株与菌株与F菌株间的接合，就可以使后者亦转变菌株间的接合，就可以使后者亦转变成成F 菌株。它既获得了菌株。它既获得了F因子，同时又获得了来自初生因子，同时又获得了来自初生F 菌株若干新菌株若干新的遗传性状。所以，次生的遗传性状。所以，次生F 细胞是一个部分双倍体。细胞是一个部分双倍体。山东农业大学生命科学学院F质粒四种存在方式及相互关系：质粒四种存在方式及相互关系：山东农业大学生命科学学院F+（“雄性雄性”）菌株）菌株指细胞内存在一至几个指细胞内存在一至几个F F质粒，并在细胞表面着生一至几质粒，并在细胞表面着生一至几条性菌毛的大肠杆菌菌株条性菌毛的大肠杆菌菌株F F+菌株与菌株与F-F-菌株的接合：菌株的接合：F F+菌株与菌株与F F-菌株通过性菌毛的沟菌株通过性菌毛的沟通和收缩，将通和收缩，将F F质粒由质粒由F F+菌株转移到菌株转移到F F-菌株中，同时菌株中，同时F F+菌菌株中的株中的F F质粒也获得复制，使两者都变成质粒也获得复制，使两者都变成F F+菌株。菌株。通过接合而转性别的频率接近通过接合而转性别的频率接近100100接合的具体过程接合的具体过程山东农业大学生命科学学院因子的传递过程（接合的具体过程）为：因子的传递过程（接合的具体过程）为：因子的传递过程（接合的具体过程）为：因子的传递过程（接合的具体过程）为：F质粒的一条单链在特定位点产生缺口，形成供体单链质粒的一条单链在特定位点产生缺口，形成供体单链DNA。以以滚环模型方式滚环模型方式复制复制F质粒：在断裂的单链质粒：在断裂的单链B逐步解开的同时，逐步解开的同时，留存环状单链留存环状单链A边滚动、边以自身模板合成互补单链边滚动、边以自身模板合成互补单链A；同时含；同时含裂口的单链裂口的单链B以以5端为先导，以线形方式经过性菌毛而转移到端为先导，以线形方式经过性菌毛而转移到F-质粒中。质粒中。在受体内线形外源在受体内线形外源DNA单链合成互补双链，经环化后形成新的单链合成互补双链，经环化后形成新的F质粒。质粒。山东农业大学生命科学学院F-（“雌性雌性”）菌株）菌株细胞中无细胞中无F F质粒，细胞表面也无性菌毛的菌株质粒，细胞表面也无性菌毛的菌株F F菌株可通过与菌株可通过与F F+菌株或菌株或FF菌株的接合而接受菌株的接合而接受供体菌中的供体菌中的F F质粒或质粒或FF质粒质粒通过接合接受来自通过接合接受来自HfrHfr菌株的一部分或一整套核菌株的一部分或一整套核基因组基因组从自然界分离得到的从自然界分离得到的20002000个个E.coliE.coli菌株中菌株中F F-仅占仅占3030左右左右山东农业大学生命科学学院Hfr（高频重组）菌株（高频重组）菌株高频重组（高频重组（Hfr，High frequency recombination Strain）：）：F质粒从游离态转变成在核染色体组特定位点上的整合态，质粒从游离态转变成在核染色体组特定位点上的整合态，从而提高与从而提高与F-菌株接合基因重组频率的菌株接合基因重组频率的E.coli菌株类型。菌株类型。Hfr菌株与菌株与F-菌株接合后发生基因重组的频率比单纯用菌株接合后发生基因重组的频率比单纯用F+菌菌株和株和F-菌株接合的频率要高数百倍。菌株接合的频率要高数百倍。Hfr与与F-菌株的接合过程菌株的接合过程山东农业大学生命科学学院Hfr与与F-菌株的接合过程菌株的接合过程Hfr与与F-细胞配对细胞配对通过性菌毛使两个细胞直接接触，并形成接合管通过性菌毛使两个细胞直接接触，并形成接合管发生接合中断发生接合中断外源双链外源双链DNA片段与受体菌的染色体片段与受体菌的染色体DNA双链进行双交双链进行双交换，产生稳定的接合子换，产生稳定的接合子山东农业大学生命科学学院Hfr与与F-菌株间的接合中断试验菌株间的接合中断试验F因子不易转入受体细胞因子不易转入受体细胞中，故中，故HfrF-杂交后的受杂交后的受体细胞（或称接合子）大体细胞（或称接合子）大多数仍然是多数仍然是F-。山东农业大学生命科学学院中断杂交实验和基因定位中断杂交实验和基因定位 接合中断法绘制环状染色体图接合中断法绘制环状染色体图接合中断法绘制环状染色体图接合中断法绘制环状染色体图接合中断法（接合中断法（Interruptedmatingexperiment）获得接合子获得接合子按照接合中按照接合中DNA转移过程的严格顺序性及接合中断试转移过程的严格顺序性及接合中断试验，可画出环状染色体图验，可画出环状染色体图山东农业大学生命科学学院接合中断法接合中断法山东农业大学生命科学学院F 菌株菌株Hfr菌株细胞内的菌株细胞内的F质粒由于不正常切割而脱离核染色体组质粒由于不正常切割而脱离核染色体组时重新形成的游离的携带整合位点一小段核染色体基因的时重新形成的游离的携带整合位点一小段核染色体基因的特殊特殊F质粒，或质粒，或F因子。因子。初生初生F菌株菌株 次生次生F 菌株菌株带有插入细菌基因的环状带有插入细菌基因的环状F因子是一个复制子，称为因子是一个复制子，称为F因子。因子。利用利用F因子形成部分二倍体，以因子形成部分二倍体，以F质粒传递供体基因的方质粒传递供体基因的方式，称为：性导式，称为：性导 (sexduction）、）、F质粒转导或质粒转导或F因子转导因子转导（F-duction)、F质粒媒介的转导。质粒媒介的转导。山东农业大学生命科学学院初生初生F菌株与次生菌株与次生F菌株的由来菌株的由来山东农业大学生命科学学院细细菌菌基基因因交交流流的的主主要要方方式式山东农业大学生命科学学院（四）原生质体融合（四）原生质体融合（四）原生质体融合（四）原生质体融合（protoplast fusionprotoplast fusion）1、概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的、概念：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（fusant）的过的过程，称为原生质体融合。程，称为原生质体融合。2、进行原生质体融合的生物种类、进行原生质体融合的生物种类 原核生物：细菌、放线菌原核生物：细菌、放线菌 真核生物：酵母菌、霉菌和蕈菌、植物细胞、人真核生物：酵母菌、霉菌和蕈菌、植物细胞、人 和和动物细胞动物细胞3、原生质融合的主要步骤：、原生质融合的主要步骤：p2321、选择具有遗传标记的亲株、选择具有遗传标记的亲株为了有利于重组子的检出，必须选择已知的或用诱变方法获得的为了有利于重组子的检出，必须选择已知的或用诱变方法获得的营养缺陷型或抗药性标记菌株作为亲株，同时要求标记必须稳定。营养缺陷型或抗药性标记菌株作为亲株，同时要求标记必须稳定。2、原生质体的制备、原生质体的制备选择合适的酶系进行细胞脱壁，细菌多用溶菌酶，真菌多用选择合适的酶系进行细胞脱壁，细菌多用溶菌酶，真菌多用纤维素酶，酵母菌用蜗牛酶等。纤维素酶，酵母菌用蜗牛酶等。3、原生质体融合、原生质体融合把二亲株原生质体混合在一起，用把二亲株原生质体混合在一起，用PEG（聚乙二醇）助聚乙二醇）助融，然后将融合子涂布在再生平板上，保温后检出重组子。融，然后将融合子涂布在再生平板上，保温后检出重组子。4、再生、再生再生是一个十分关键的问题，因为不同微再生是一个十分关键的问题，因为不同微生物的原生质体所要求的最适条件不同。生物的原生质体所要求的最适条件不同。5、重组子的检出、重组子的检出融合子重组的测定，通常采用染色体标记的遗传融合子重组的测定，通常采用染色体标记的遗传重组来检测，如二亲株的遗传标记为营养缺陷型重组来检测，如二亲株的遗传标记为营养缺陷型A+B-及及A-B+，则其重组子应为原养型则其重组子应为原养型A+B+。检出重组子检出重组子一般可用二个方法：直接法和间接法。一般可用二个方法：直接法和间接法。原生质体融合的操作示意图原生质体融合的操作示意图山东农业大学生命科学学院检出重组子一般可用二个方法：检出重组子一般可用二个方法：直接法：将融合液涂布在不补充二亲株生长所需营养物直接法：将融合液涂布在不补充二亲株生长所需营养物或补充有两种药物的再生平板上，直接筛选出原养型的或补充有两种药物的再生平板上，直接筛选出原养型的或双重药物抗性的重组子；或双重药物抗性的重组子；间接法：将融合液涂布在丰富的再生平板上，使亲株及间接法：将融合液涂布在丰富的再生平板上，使亲株及重组子都再生而长成细胞，然后用影印法或牙签法转到重组子都再生而长成细胞，然后用影印法或牙签法转到选择性培养基上检出重组子，此法对某些有表型延迟作选择性培养基上检出重组子，此法对某些有表型延迟作用的遗传标记，较直接法有利，不至于因直接筛选而产用的遗传标记，较直接法有利，不至于因直接筛选而产生干扰。生干扰。山东农业大学生命科学学院二、真核微生物的基因重组二、真核微生物的基因重组有性杂交有性杂交准性杂交准性杂交原生质体融合原生质体融合遗传转化遗传转化山东农业大学生命科学学院（一）有性杂交（一）有性杂交（一）有性杂交（一）有性杂交（sex hybridizationsex hybridization）杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。杂交是在细胞水平上发生的一种遗传重组方式。1.有有性性杂杂交交：有有性性杂杂交交，一一般般指指性性细细胞胞间间的的接接合合和和随随之之发发生生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。2.进行有性杂交的微生物进行有性杂交的微生物 产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌产生有性孢子的酵母菌、霉菌和蕈菌山东农业大学生命科学学院酿酒酵母（酿酒酵母（S.cerevisiae）的有性杂交的有性杂交步骤：步骤：单倍体的制备：含醋酸钠或其他产孢子培养基单倍体的制备：含醋酸钠或其他产孢子培养基接触杂交接触杂交有性杂交后代双倍体有性杂交后代双倍体优良性状个体筛选优良性状个体筛选双、单倍体酵母细胞的比较双、单倍体酵母细胞的比较山东农业大学生命科学学院双、单倍体酵母细胞的比较双、单倍体酵母细胞的比较双、单倍体酵母细胞的比较双、单倍体酵母细胞的比较山东农业大学生命科学学院有性杂交的实例有性杂交的实例酒精发酵酵母酒精发酵酵母产酒率高，对麦芽糖和葡萄糖发酵力弱面包发酵酵母面包发酵酵母产酒率低、对麦芽糖和葡萄糖发酵力强产酒率低、对麦芽糖和葡萄糖发酵力强上面二者的综合上面二者的综合同时用作酒精高产菌种和面包发酵菌种山东农业大学生命科学学院（二）准性杂交（二）准性杂交（二）准性杂交（二）准性杂交（parasexual hybridizationparasexual hybridization）1.1.准性生殖（准性生殖（parasexual reproductionparasexual reproduction）：）：是是一一种种在在同同种种而而不不同同菌菌株株的的体体细细胞胞间间发发生生的的融融合合，它它可可不不借借减减数数分分裂裂而而导导致致低低频频率率基基因因重重组组并并产产生生重重组组子子。也也可可认认为为是是在在自自然然条条件件下下，真真核核微微生生物物体体细细胞胞间间发发生生的的一一种种自自发发性性的的原原生生质质体融合现象。体融合现象。山东农业大学生命科学学院2.准性生殖过程：准性生殖过程：菌丝联结菌丝联结形成异核体形成异核体核融合或核配核融合或核配体细胞交换和单倍体化体细胞交换和单倍体化 单倍体杂合子单倍体杂合子以灰黄霉素生产菌的育种为例，说明准准性性杂交杂交方法的主要步骤。半知菌的准性生殖示意图半知菌的准性生殖示意图半知菌的准性生殖示意图半知菌的准性生殖示意图山东农业大学生命科学学院准性生殖与有性生殖的比较准性生殖与有性生殖的比较山东农业大学生命科学学院3.3.准性杂交育种（准性杂交育种（Breeding by parasexualityBreeding by parasexuality）灰黄霉素产生菌灰黄霉素产生菌灰黄霉素产生菌灰黄霉素产生菌Penicillium urticaePenicillium urticaePenicillium urticaePenicillium urticae（荨麻青梅）的准性（荨麻青梅）的准性（荨麻青梅）的准性（荨麻青梅）的准性杂交育种杂交育种杂交育种杂交育种 选择亲本选择亲本选择亲本选择亲本 强制异合强制异合强制异合强制异合 移单菌落移单菌落移单菌落移单菌落 验稳定性验稳定性验稳定性验稳定性 促进变异促进变异促进变异促进变异 筛选杂合单倍体筛选杂合单倍体筛选杂合单倍体筛选杂合单倍体山东农业大学生命科学学院准性杂交原理准性杂交原理finish山东农业大学生命科学学院三、基因工程三、基因工程微生物育种的发展史：微生物育种的发展史：u初级阶段：生产选种和初级的定向选育u物理因素诱变育种u化学诱变育种u杂交育种u基因工程山东农业大学生命科学学院一、基因工程的定义一、基因工程的定义基因工程在基因水平上的遗传工程。利用分子生物学的理论和技基因工程在基因水平上的遗传工程。利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心 基因组，使基因组，使生物体的遗传性状发生定向变异，以满足于人类的需要。生物体的遗传性状发生定向变异，以满足于人类的需要。基因工程（基因工程（genetic engineering）：是用人为方法将所需要的