-黄酮及金属离子对葡萄糖苷酶的抑制作用研究课件.ppt

2023/5/26更多医学精品更多医学精品尽在医学吧尽在医学吧2023/5/26化学生物学化学生物学综合合实验六六 指指导教教师：马林林 化化学与学与化化学学工程工程学学院院黄黄酮及金属离子及金属离子对-葡萄糖苷葡萄糖苷酶的抑制作用研究的抑制作用研究 2023/5/26一、一、实验基本原理基本原理-葡萄糖苷葡萄糖苷酶(-glucosidase)是一是一类能能够从含有从含有-葡萄糖苷葡萄糖苷键底物的非底物的非还原端催化水解原端催化水解-葡萄糖基的葡萄糖基的酶的的总称，包括麦芽糖称，包括麦芽糖酶、异麦芽糖、异麦芽糖酶、蔗、蔗糖糖酶等，又叫等，又叫-D-葡萄糖苷水解葡萄糖苷水解酶。位于小位于小肠绒毛粘膜毛粘膜细胞刷状胞刷状缘的的-葡葡萄糖苷萄糖苷酶在机体的代在机体的代谢过程中起着十程中起着十分关分关键的作用，参与了人体的作用，参与了人体对摄入的入的淀粉和蔗糖等碳水化合物的消化吸收、淀粉和蔗糖等碳水化合物的消化吸收、糖蛋白和糖脂的加工，与糖蛋白和糖脂的加工，与许多因代多因代谢紊乱失紊乱失调而引起的疾病、神而引起的疾病、神经细胞的胞的分化、分化、肿瘤的瘤的转移以及病毒和移以及病毒和细菌的菌的感染有密切关系。感染有密切关系。另外在生物体内，大多数蛋白另外在生物体内，大多数蛋白质都是以糖蛋白形式存在，它都是以糖蛋白形式存在，它们包括包括酶、免疫球蛋白、免疫球蛋白、载体体蛋白、激素、毒素、凝集素和蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白，涉及到构蛋白，涉及到细胞胞识别、信息信息传递、激素、激素调节、受精、受精、发生、生、发育、分化、神育、分化、神经系系统和免疫系和免疫系统恒恒态维持等各个方持等各个方面的功能。面的功能。许多疾病的多疾病的发生和生和发展，如炎症及自身免疫疾病、展，如炎症及自身免疫疾病、老化、癌老化、癌细胞异常增殖及胞异常增殖及转移、移、病原体感染等都与糖蛋白寡糖病原体感染等都与糖蛋白寡糖链的的变化密切相关。化密切相关。2023/5/26-葡萄糖苷葡萄糖苷酶抑制抑制剂v因因此此，通通过抑抑制制-葡葡萄萄糖糖苷苷酶的的活活性性可可以以达达到到治治疗某某些些疾疾病病的的目目的的，研研究究最最为成成熟熟的的是是治治疗型型糖糖尿尿病的口服降糖病的口服降糖药物。物。v其其作作用用机机制制为：竞争争性性抑抑制制位位于于小小肠的的各各种种-葡葡萄萄糖糖苷苷酶，使使淀淀粉粉类分分解解为葡葡萄萄糖糖的的速速度度减减慢慢，从从而而减减缓肠道道内内葡葡萄萄糖糖的的吸吸收收，降低餐后高血糖。降低餐后高血糖。v同同样也可以也可以针对糖糖链的的变化，利用小分子化合物抑化，利用小分子化合物抑制糖苷制糖苷转移移酶和糖苷和糖苷酶的的催化活性，可以控制糖催化活性，可以控制糖链的合成和水解，从而达到的合成和水解，从而达到治治疗疾病的目的。疾病的目的。v因此，能因此，能够阻断寡糖阻断寡糖链生生物合成的物合成的-葡萄糖苷葡萄糖苷酶抑抑制制剂，也被用作抗病毒和，也被用作抗病毒和抗抗肿瘤的瘤的药物。物。2023/5/262023/5/26二、二、实验过程程酶抑制抑制剂的高通量的高通量筛选可以可以通通过酶标仪进行，但系行，但系统地、地、准确地研究抑制准确地研究抑制剂的的IC50以以及抑制作用的及抑制作用的动力学必力学必须通通过精密精密仪器器进行行检测。本本实验将利用紫外将利用紫外-可可见分分光光度光光度计测试几种化合物几种化合物对酵母酵母-葡萄糖苷葡萄糖苷酶 的抑制的抑制作用以及作用以及协同抑制作用。同抑制作用。实验材料：材料：酵母酵母-葡萄糖苷葡萄糖苷酶（Sigma公司）。公司）。抑制抑制剂：槲皮素、染料：槲皮素、染料木素、葡萄糖、果糖、木素、葡萄糖、果糖、硫酸硫酸铜、氯化化锌。底物：底物：对硝基苯酚葡萄硝基苯酚葡萄糖苷（糖苷（pNPG，Sigma公司）公司）2023/5/26实验仪器和条件器和条件北京普析通用北京普析通用UV-1901 UV-1901 紫外紫外可见分光光度计可见分光光度计实验条件：实验条件：缓冲液：缓冲液：0.01mol/LpH 6.80.01mol/LpH 6.8或或7.07.0磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液。底物：底物：3mg/mL对硝基苯酚硝基苯酚葡萄糖苷；葡萄糖苷；化合物溶液的配制：化合物溶液的配制：槲皮素、染料木素用槲皮素、染料木素用DMSODMSO配配成成5050 mol/Lmol/L。葡萄糖、果糖用水配成葡萄糖、果糖用水配成100100 mol/Lmol/L。氯化锌和硫酸铜用蒸馏水配氯化锌和硫酸铜用蒸馏水配成成5050 mol/Lmol/L。2023/5/26实验安排安排1 1，酶催化条件探索，酶催化条件探索 由于每次实验得到的酶由于每次实验得到的酶催化活性不同，所以每次在催化活性不同，所以每次在测试过程中，需要探索实验测试过程中，需要探索实验中所使用的酶的剂量。中所使用的酶的剂量。本实验要求测试的酶催本实验要求测试的酶催化活性化活性-每分钟每分钟ODOD值变化在值变化在0.1-0.130.1-0.13范围内。本实验采范围内。本实验采用调节酶液用量或增加底物用调节酶液用量或增加底物用量的方式。用量的方式。2 2，测试体系，测试体系在总计在总计10001000 L L的测试体系的测试体系中，加入中，加入920920或或930930 L L0.01mol/LpH 6.80.01mol/LpH 6.8磷酸盐缓磷酸盐缓冲液，冲液，1010 L L样品溶液（以样品溶液（以10 10 L L缓冲液或缓冲液或DMSODMSO做对照）做对照），10-2010-20 L L酶液，室温放置酶液，室温放置2020分钟，立即加入分钟，立即加入20-5020-50 L L 3mg/mL3mg/mL对硝基苯酚葡萄糖苷硝基苯酚葡萄糖苷溶液，溶液，400nm400nm进行时间扫描，进行时间扫描，记录记录1 1分钟的分钟的ODOD值值.2023/5/262023/5/26实验安排安排4 4，抑制剂动力学的测试，抑制剂动力学的测试 适当选择适当选择2 2个不同的样品浓个不同的样品浓度，以及没加样品三个系列，度，以及没加样品三个系列，改变底物溶液的剂量，分别测改变底物溶液的剂量，分别测试酶催化活性。试酶催化活性。以底物浓度（以底物浓度（mol/Lmol/L）倒）倒数数1/S1/S对酶催化活性对酶催化活性OD/minOD/min值的倒数值的倒数1/V1/V作图，根据三条作图，根据三条线的交点判断抑制剂的类型。线的交点判断抑制剂的类型。2023/5/26协同抑制作用研究同抑制作用研究v酶是生物体内重要的生物大分子，有着特殊的催化功能，是生物体内重要的生物大分子，有着特殊的催化功能，与与许多疾病的多疾病的产生和生和发展都有着密切展都有着密切联系，是系，是药物开物开发设计的一个常的一个常见的靶点。而且，的靶点。而且，酶除了其活性中心可以与除了其活性中心可以与专一的底物互相一的底物互相结合外，其他的部位也可以与不同的物合外，其他的部位也可以与不同的物质结合，使合，使酶的活性的活性发生改生改变。v因此，我因此，我们可以可以设想用不用抑制想用不用抑制类型的抑制型的抑制剂同同时对酶进行抑制，行抑制，产生生协同抑制的效果，令同抑制的效果，令酶的活性比使用的活性比使用单一抑一抑制制剂时更低的同更低的同时，也可以减少抑制，也可以减少抑制剂的用量，的用量，产生生1+12的效果。的效果。v由于由于-葡萄糖苷葡萄糖苷酶有多个性有多个性质不同的抑制位点，因此我不同的抑制位点，因此我们可以推可以推测，利用不同，利用不同类型的抑制型的抑制剂(竞争性抑制争性抑制剂、非、非竞争性抑制争性抑制剂以及金属离子以及金属离子)可以起到可以起到协同抑制的效果。同抑制的效果。2023/5/262023/5/26三、实验报告三、实验报告两名学生只对自己所做的实验过程和结果进行两名学生只对自己所做的实验过程和结果进行分析，按照研究论文形式写出实验报告。分析，按照研究论文形式写出实验报告。实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实实验中尽可能了解其他同学的实验过程和实验结果，如果可能结合起来一起进行分析。验结果，如果可能结合起来一起进行分析。采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测采用四人一组，每两人选择两个化合物进行测试。因为每个实验由试。因为每个实验由10个点构成，可以去掉几个点构成，可以去掉几个点得到比较理想的曲线。个点得到比较理想的曲线。1232023/5/262023/5/26更多医学精品更多医学精品尽在医学吧尽在医学吧