生化实验设计自制课件.ppt

20122012级本科生化及分子生物学实级本科生化及分子生物学实验设计验设计年级、专业、班级：年级、专业、班级：20122012级临床级临床实验课时间：实验课时间：2013.6.192013.6.19实验室：实验室：组别：组别：组员排名：（排名不分先后）组员排名：（排名不分先后）报告人：报告人：u案例：u 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。u临床表现：u 体格检查为体温38，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞 1.981012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5mol/L，结合胆红素13.7mol/L，未结合胆红素71.8mol/L，尿蛋白（+），潜血(+)，尿胆红素()，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。u1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？u2.请设计实验进一步明确诊断。u要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。u3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。u4.要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因?u5.患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？1.根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？答：根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿患 急性溶血贫血症蚕豆病。蚕豆病的症状：在生吃蚕豆后数小时至数日（1-3日）内突然发热、头晕、烦躁、恶心，尿呈酱油样或葡萄酒色，一般发作26天后能自行恢复，但若重者不及时抢救，会因循环衰竭危及生命。与上述患儿的临床表现大致相同，所以初步判定该病为蚕豆病。2.设计实验进一步明确诊断u根据蚕豆病的诊断原理本组设计的实验检查高铁血红蛋白还原试验来进一步明确诊断实验名称 高铁血红蛋白还原法u实验原理：u正常血红蛋白是亚铁血红蛋白，可被亚硝酸氧化为高铁血红蛋白。当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶含量正常时，通过戊糖循环形成的还原型辅酶可作为血液中高铁血红还原酶的辅酶，并在递氢体美蓝的参与下，使形成的高铁血红蛋白还原为亚铁血红蛋白。当红细胞内缺少葡萄糖-6-磷酸脱氢酶时，则高铁血红蛋白不能被还原。高铁血红蛋白为灰暗色，在630650nm波长处吸光度最高，故可加以测定。u主要试剂:u（1）12.5g/mL亚硝酸葡萄糖溶液 取亚硝酸纳1.25g，葡萄糖5g，蒸馏水加至100ml。u（2）0.0001mol/L美蓝溶液 取美蓝0.15g，蒸馏水加至100ml。u（3）0.02mol/L磷酸盐缓冲溶（PH7.4）称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）51mg，磷酸二氢钾52.2mg，加蒸馏水至100ml。u主要仪器：u可见分光光度计 离心机 恒温水浴箱 移液器 小试管u实验操作流程：u（1）静脉取血1.52.0ml，加于含有3.8%柠檬酸钠抗凝剂的小试管内，血液和抗凝剂按9:1混合，加葡萄糖20mg。u（2）将此标本离心沉淀5min（1000 r/min1000 r/min）或放置4冰箱过夜，待红细胞下沉后吸去部分血浆，使红细胞与血浆比列约为1:1（相当红细胞比容35%40%）。u（3）摇匀后取此血液1ml，加12.5g/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液和0.0001mol/L美蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与空气中的氧气充分接触，加塞，置于37水浴（或保温箱）3h。u注意事项：u（1）受检者红细胞比容对结果有一定影响，比容低于30%时，高铁血红蛋白还原率可明显降低故贫血患者应先调整红细胞比容后再测定。u（2）抗凝剂以38g/L柠檬酸或输血时用的抗凝剂ACD为好，血液标本可保存1周左右。肝素抗凝剂可用（每毫升血液用肝素0.5mg），但标本只能保存3天。草酸盐抗凝不适于本法。u（3）ACD抗凝剂不宜太多，血液与ACD抗凝剂按1:0.15混合即可，否则可因PH降低，而使高铁血红蛋白还原速度减慢，以致出现假阳性。u意义：u在临床上，通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的测定，对于研究药物试验引起的溶血性贫血具有诊断价值。根据不同敏感人体内红细胞中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性水平的变化情况，可分为：（1）药物引起的变化；（2）非药物引起的变化；（3）蚕豆病以及其他疾病引起的变化。u对于那些可能接触过敏感药剂的人员，特别是那些使用抗疟疾药的人，业已推荐葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性缺陷作为一种鉴别指标。甚至当输血后因溶血作用而使红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷，这是由于输血者的血液中可能隐藏了潜在的溶血因素。6-磷酸葡萄糖G-6-PD6-磷酸葡萄糖酸酯NADP+NADPH(还原型辅酶)谷胱甘肽还原酶2G-SH抗氧化活性5-磷酸核糖（多步反应）3.从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果查结果（氧化型）GS-SG 4.要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？术检测什么目的基因？蚕豆病的患者红细胞蚕豆病的患者红细胞葡萄糖葡萄糖-6-磷酸脱氢酶磷酸脱氢酶（G6PD）有遗传缺陷）有遗传缺陷，故需要检测能指导，故需要检测能指导合成葡萄糖合成葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因磷酸脱氢酶的基因uDNA芯片uPCR技术uDNA探针技术 u荧光斑点法uDNA印记技术u凝胶电泳凝胶电泳u酵母双杂交系统酵母双杂交系统uDNA测序测序u目的基因：G6PDG6PD基因（位于人类基因组的基因（位于人类基因组的X X染色染色体的长臂体的长臂2828带）带）Xq28片段5.体型体型瘦小与该疾病是否有关，为什么？核酸（DNA,RNA）受影响蛋白质合成与表达受限营养不良某些肽类激素（如甲状腺激素，生长激素）NADPH脂肪酸合成瘦弱吞噬细胞的免疫作用体弱多病（1）5-磷酸核糖有一定关系（2）其他因素营养摄入不足，不均衡父母遗传缺乏运动u所以，本组成员认为：所以，本组成员认为：两者是有关的，患者由于两者是有关的，患者由于G6PDG6PD缺乏，导致缺乏，导致糖代谢中氧化磷酸化受阻，脂肪代谢加强，糖代谢中氧化磷酸化受阻，脂肪代谢加强，身体所需能量、营养获取受限或无法及时身体所需能量、营养获取受限或无法及时供给，各循环、调节、代谢失衡，因而导供给，各循环、调节、代谢失衡，因而导致体型瘦小。致体型瘦小。