毕业设计-不同来源茶薪菇多糖抗氧化活性比较研究论文.doc

目录1 前言.12 材料与方法.12.1 材料、试剂与仪器.12.2 实验方法.22.2.1实验流程.22.2.2菌种活化.22.2.3平板扩大培养.22.2.4摇瓶培养.22.2.5茶薪菇胞内多糖提取、纯化.22.2.6茶薪菇胞外多糖提取、纯化.32.2.7茶薪菇子实体多糖提取、纯化.32.2.8多糖还原力测定.32.2.9清除羟自由基能力测定.42.2.10清除超氧自由基能力测定.4 3 结果分析.53.1 多糖还原力测定.53.2 多糖清除羟自由基能力测定.53.3 多糖清除超氧阴离子自由基能力测定.64 讨论.74.1 茶新菇菌丝体发酵培养的影响条件.74.2 茶新菇多糖提取的影响条件.74.3茶新菇多糖还原力的影响条件.74.4茶薪菇多糖清除羟自由基的影响.74.5茶薪菇多糖清除超氧阴离子自由基的影响.85 结论.8参考文献.9致谢.109廊 坊 师 范 学 院 本科生毕业论文（设计） 题 目：不同来源茶薪菇多糖抗氧化活 性比较研究 姓 名：姚海淋指导教师：谢春艳系 别：生物工程专 业：生物技术年 级：2009级本科1班 完成日期 2013年5月20日 不同来源茶薪菇多糖抗氧化活性比较研究摘 要 采用液体深层发酵的方法，获得茶薪菇菌丝体和发酵液。以热水浸提、乙醇沉淀的方法，分别从茶薪菇子实体、菌丝体和发酵液中提取粗多糖。再经法脱蛋白，冷冻干燥，得多糖粉。参考的方法，分别测定三种多糖来源的还原力；通过水杨酸法检测多糖提取物对羟基自由基的清除作用；对邻苯三酚自氧化系统产生的超氧阴离子自由基的清除作用；对三种不同来源多糖进行体外抗氧化活性研究。表明：来源于茶薪菇子实体、菌丝体、发酵液的多糖提取物均有较强的体外抗氧化性能，随着多糖浓度增大，抗氧化活性逐渐增强；来源于子实体多糖的还原力最强，菌丝体多糖次之，发酵液多糖最弱；来源于子实体多糖对羟基自由基清除能力最强，发酵液多糖次之，菌丝体多糖最弱；来源于子实体多糖清除超氧阴离子自由基的能力最强，发酵液多糖次之，菌丝体多糖最弱。关键词茶薪菇菌丝体发酵液多糖抗氧化The research of different sources of Agrocybechg Polysaccharides antioxidant activity.Abstract The mycelial and fermentation broth were achieved for the method of submerged fermentation methal. The polysaccharide of fruit body, mycelial and fermentation broth were extracted with hot water extraction and ethanol precipitation. Then detached the protein with the method of Sevag , freeze drying, and gained much powdered polysaccharide. Antioxidant activity of the polysaccharides from fruit body, mycelial and fermentation broth was studied by several experiments, including reducing power measure of Tsuda method and salicylic acid method. The results showed the polysaccharides extracted from fruit body, mycelial and fermentation broth all had strong antioxidant properties in vito. And with the concentration of polysaccharides increasing,its antioxidant activity gradually become strong. In the experiment of reducing power measure, fruit body had the strongest power, mycelial was the second and fermentation broth was the weakest. For the capacity of scavenging hydroxyl radical by three different polysaccharides, fruit body is showed the strongest, followed by fermentation broth and mycelial the weakest. For the capacity of scavenging superoxide radical by three different polysaccharides, fruit body is showed the strongest, followed by fermentation broth and mycelial the weakest.Keywords Agrocybechg mycelial fermentation broth polysaccharides antioxidation 1 前言1.1课题背景1.1.1课题发展概况 茶薪菇，学名A grocybechg sing H nang.sp.nor，又名茶树菇、柳松茸、柳环菌。与杨树菇相似种。茶薪菇味道鲜美，口感脆嫩，香味浓郁，质地细嫩，是一种可取代金针菇、平菇的新型食用菌。其营养价值丰富,100g干品中含蛋白质14.2 g, 脂肪10.27 g，纤维素14.4 g，总糖59.93 g, 钾471.3 m g, 钠186.6 mg, 钙26.2 m g，铁42.3 mg，具有补肾健脾和止泻等功效，对高血压、心血管、肥胖症亦有疗效。本文主要对茶薪菇水溶性多糖的提取工艺进行了优化，同时对其在体外对氧自由基的清除效果进行了探讨。 关于食用菌多糖的研究报道较多。多糖的抗氧化性对增强机体免疫力，抗衰老，抗肿瘤，抗辐射等具有重大作用，可以预防很多疾病的发生。几十种食用菌多糖的药物制剂都已投放市场，而对茶薪菇多糖的研究报道较少，特别是不同来源的茶薪菇报道还未曾发表。本实验采用微生物发酵培养法获得茶薪菇菌丝体和发酵液，再利用乙醇沉淀法分别提取来源于菌丝体、发酵液、子实体的多糖。再通过测定还原力大小及清除羟自由基能力，进行比较研究，进而确定哪种来源的多糖抗氧化活性最强。为进一步研究茶薪菇多糖的提取及其抗氧化性提供理论依据。2.材料与方法2.1材料，试剂与仪器 实验材料：茶薪菇子实体 茶薪菇菌丝体 土豆 实验试剂：葡萄糖 琼脂 KH2P04 MgSO4 Na2HPO4 VB1 HCL 氢氧化钠 氯仿 正丁醇无水乙醇 磷酸盐缓冲液（PBS, pH 6.6） 六氰合铁酸钾 三氯乙酸（TCA） 蒸馏水 三氯化铁 FeSO4 水杨酸钠 H202 溶液 邻苯三酚 抗坏血酸 Tris-HCl缓冲溶液（PH8.2) 实验仪器：培养皿 冷冻干燥箱 BS-2F振荡培养箱（国华电器有限公司）TDL-40B低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）S22PC型分光光度计（上海棱光有限公司）LS-3750高压蒸汽灭菌锅（SANYO）HH-4,HH-6恒温水浴锅（国华电器有限公司）FA2004B电子分析天平（上海精密仪器有限公司）ZHTH-C1115C智能型安全超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）BCD-256KF低温冰箱（青岛海尔股份有限公司）ZRD-5210恒温鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司）2.2实验方法2.2.1实验流程 茶薪菇菌种活化扩大培养摇瓶培养发酵液与菌丝体多糖的提取多糖抗氧化性的测定 茶薪菇子实体多糖的提取多糖抗氧化活性测定2.2.2菌种活化 以PDA培养基为茶薪菇保藏及活化培养基（土豆200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L, KH2PO4 0.1 %, MgSO4 0.05 %、VB1100 mg/L）2.2.3 平板扩大培养 无菌操作接种平板培养基上，25培养7d，使菌丝布满平板。2.2.4 摇瓶培养 配置液体培养基（土豆200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L, KH2PO4 0.1 %, MgSO4 0.05 %、VB1100 mg/L）。将液体培养基装在三角瓶中，常规方法灭菌后在超净工作台接种，接种10%，摇床培养，27，140r/min，发酵培养7d。 发酵结束时，取发酵液离心得到发酵上清液和发酵菌丝体。（或者采用4层纱布过滤，纱布上层物质为菌丝体，发酵液经纱布滤出）2.2.5 茶薪菇胞内多糖提取、纯化称取一定量的茶薪菇菌丝体，按料液比1:10比例加入蒸馏水，搅拌均匀，用HCl溶液或NaOH溶液将pH值调至8.0，在提取温度90 浸提2h，而后将浸提液于4000rpm下离心30min，弃沉淀得上清液；取上清液置于烧杯中加入4倍体积的无水乙醇，搅拌后静置1h，4000 rpm离心15min，弃上清，得沉淀；沉淀即为提取的胞内粗多糖。将多糖沉淀于原三角瓶内用50ml蒸馏水（热水）复溶，经Sevag法将提取液与Sevag试剂(氯仿:正丁醇=4:1（V/V） 5:1 混合，振荡30min，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevag试剂交界处，用分液漏斗分离出多糖溶液）脱蛋白，反复多次直至无白色出现止，脱蛋白后的溶液即为待测的多糖溶液，采用冷冻干燥法获得胞内多糖粉。2.2.6茶薪菇胞外多糖提取、纯化胞外多糖提取、纯化：取发酵液，于90水域中浓缩至体积50%，将其置于烧杯中加入4倍体积的无水乙醇，搅拌后静置1h，4000 rpm离心15min，弃上清，得沉淀；沉淀即为提取的胞外粗多糖。将多糖沉淀于原三角瓶内用50ml蒸馏水（热水）复溶，经Sevag法将提取液与Sevag试剂(氯仿:正丁醇=4:1（V/V） 5:1 混合，振荡30min，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevag试剂交界处，用分液漏斗分离出多糖溶液）脱蛋白，反复多次直至无白色出现止，脱蛋白后的溶液即为待测的多糖溶液，采用冷冻干燥法获得胞外多糖粉。 2.2.7茶薪菇子实体多糖提取、纯化将购买的茶薪菇子实体洗净，于50 鼓风干燥箱中烘至恒重，置高速组织搅拌机中粉碎成粉末，密封保存备用。称取一定量的茶薪菇粉末，按料液比1:20比例加入蒸馏水，搅拌均匀，用HCl溶液或NaOH溶液将pH值调至8.0，在提取温度90 浸提2h，而后将浸提液于4000rpm下离心30min，弃沉淀得上清液；取上清液置于烧杯中加入4倍体积的无水乙醇，搅拌后静置1 h，4000 rpm离心15min，弃上清，得沉淀；沉淀即为提取的粗多糖。将多糖沉淀于原三角瓶内用50ml蒸馏水（热水）复溶，经Sevag法将提取液与Sevag试剂(氯仿:正丁醇=4:1（V/V） 5:1 混合，振荡30min，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevag试剂交界处，用分液漏斗分离出多糖溶液）脱蛋白，反复多次直至无白色出现止，脱蛋白后的溶液即为待测的多糖溶液，采用冷冻干燥法获得子实体多糖粉。2.2.8多糖还原力测定 在Tsuda等方法17基础上加以调整。分别取0.5、1、2、4和8 mg/mL的样品溶液1.0 mL，依次加入3.0 mL 0.5 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS, pH 6.6）和2.5 mL1%六氰合铁酸钾溶液（K3Fe(CN)6），于50 水浴20 min，快速冷却后，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液（TCA），以3000 rpm的转速离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，充分混匀，静置10 min后，于700 nm下测定其吸光值，以蒸馏水作参比。重复做多次实验，找出数值相近的三组数据。2.2.9清除羟自由基能力测定 参考Smirnoff等的方法，并略有改动其原理是FeSO4 与 H2O2反应产生·OH，以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。实验设三个组:样品组、 对照组、 本底组。样品组中含有 9mmol /L FeSO4 ，9mmol /L水杨酸钠 , 8.8mmol /L H2O2 以及不同质量浓度的多糖(0.25、 0.5、 1、 2、 4mg/mL) 各2ml;对照组中用蒸馏水代替多糖;本底组中以蒸馏水代替水杨酸钠。最后加入 H2O2 启动反应 , 37 水浴1h,离心后取上清,以蒸馏水调零,测510nm OD值,吸光值越小,清除效果越好。按下式计算·OH清除率: E= A0 - (A- Ai) /A0 × 100%式中E为清除率；A0 为标准管 OD值；A为样品组的 OD值;Ai为本底管 OD值。重复做多次实验，找出数值相近的三组数据。2.2.10多糖清除超氧阴离子自由基能力测定 采用邻苯三酚自氧化法,邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化,释放出超氧阴离子。生成有色的中间产物,可用分光光度法进行测定，当有清除剂存在时，清除超氧阴离子，从而阻止中间产物的累积，使邻苯三酚自氧化速率降低，表现为体系的吸光度降低。取50mmol/L Tris- HCl(pH 8.2)缓冲液2.8mL，加0.1mL不同质量浓度的多糖溶液（0.5、1、2、4、8mg/ml）,放入25水浴锅中水浴10min，然后加入25预温的60mmol/L邻苯三酚0.1mL，充分混匀，准确反应 3min (加入邻苯三酚时开始计时)后，加入5%抗坏血酸(Vc)0.05mL终止反应。10min后，在420nm处测定吸光度。以等体积10mmol/L HC1代替邻苯三酚溶液为空白调零，对照组以等体积纯水代替样品。按下式计算超氧自由基清除率： E =(A0-A)/A0×100%式中 E为清除率；A0为对照组OD值；A为样品组的OD值。3.结果分析3.1不同来源多糖还原力测定 由图1可知：随着多糖浓度的升高，不同来源茶薪菇多糖还原力逐渐增强；三种不同来源茶薪菇多糖在同一浓度时，来源于子实体的多糖还原力最强，其次为菌丝体多糖，发酵液多糖还原力最弱。 图1 不同来源多糖还原力大小比较 3.2不同来源多糖清除羟自由基能力测定 由图2可知：随着多糖浓度的增高，来源于子实体，菌丝体，发酵液的多糖清除羟自由基能力逐渐增高；来源于茶薪菇子实体的多糖清除羟自由基能力最强，且远高于来源于发酵液及菌丝体的多糖；当多糖浓度为0.25mg/ml时，来源于菌丝体和发酵液多糖的清除羟自由基能力相差不大，当大于0.25mg/ml时，随着多糖浓度升高，发酵液的多糖清除羟自由基能力明显大于菌丝体的。 图2不同来源多糖清除羟自由基能力比较 3.3不同来源多糖清除超氧阴离子自由基能力测定 由图3可知：随着多糖浓度的增高，来源于子实体，菌丝体，发酵液的多糖清除超氧自由基能力逐渐增高；在同一浓度时，来源于子实体的多糖清除超氧自由基能力最强，发酵液多糖次之，菌丝体多糖最弱。 图3 不同来源多糖清除超氧自由基能力比较 4. 讨论4.1茶薪菇菌丝体发酵培养的影响条件 首先，以PDA固体培养基为菌丝体保藏及活化培养基，营养物质要充足均衡，需要加琼脂，于培养皿中活化菌丝体。其次以PDA液体培养基为菌丝体发酵培养基，调节培养基的PH为6.0，接种适量菌丝体，在140r/min.27条件下培养7d左右。温度应当控制在27左右，温度过高或过低都不利于菌丝体的生长。培养时间不能过长，如果过长，则菌丝体变老，其含糖量降低。菌球较大且颜色较淡的，溶液澄清的为最佳。如果溶液呈现浑浊，则说明已经污染。4.2茶薪菇多糖提取的影响条件首先，在PH为8的条件下，于90浸提2h，以除去一部分水分，便于提取，离心除杂质，多糖留在上清液当中。然后采用醇沉法，提取粗多糖。醇沉工艺影响多糖提取，醇沉时间、乙醇浓度以及提取温度对多糖提取率影响很大。沉淀时间短，多糖沉淀不充分，随着时间延长，多糖提取量升高。但时间过长，糖液中多糖的浓度差变小。最佳的醇沉时间为1-2h。般多糖分子量越大，被沉淀下来所需乙醇浓度越小；乙醇浓度越大，沉淀下来的多糖分子量越小，多糖得率越高。在一定范围内，随温度升高，提取量增加，但如果温度过高，则糖分子断裂。最佳提取温度为90。4.3茶薪菇多糖还原力的影响条件 实验原理为多糖样品将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾。亚铁氰化钾与Fe3+作用，生成亚铁氰化铁。亚铁氰化铁在700nm处的吸光度表示其还原力，吸光度越大，还原力越强。溶液PH值以及反应温度对亚铁氰化铁的生成，有重要影响。在PH 为6.6，50条件下，亚铁氰化铁的得率最高。4.4茶薪菇多糖清除羟自由基的影响 羟基自由基 (·OH) 是代谢过程中产生的非常活泼的自由基，毒性很大，能够造成蛋白质、核酸脂类等生物大分子的损伤，从而导致体内代谢紊乱，引起许多病理变化。因此研究茶薪菇多糖的清除羟自由基能力，对人类身体健康具有重要意义。 本实验利用FeSO4与H202反应产生·OH，以·OH氧化水杨酸所得产物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。由于多糖具有清除·OH自由基的能力，不同浓度及来源的多糖，清除能力不同，故吸光值不同。因此实验中把握H2O2与FeSO4溶液的量对实验结果具有重要作用。4.5茶薪菇多糖清除超氧阴离子自由基的影响 超氧阴离子自由基是代谢过程中非常活泼的自由基，能够引起很多病变。因此研究茶薪菇多糖的清除超氧阴离子自由基能力，对人体健康有重要意义。 本实验采用邻苯三酚自氧化法，邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化 , 释放出超氧自由基，生成有色的中间产物，可用分光光度法进行测定，当有多糖溶液存在时，清除超氧自由基，从而阻止中间产物的累积，使邻苯三酚自氧化速率降低，表现为体系的吸光度降低。5.结论 本实验对不同来源茶薪菇多糖的抗氧化活性做了系统的比较研究。结果表明：在不同来源茶薪菇多糖的还原力测定实验中，随着多糖浓度的升高，不同来源茶薪菇多糖还原力逐渐增强；三种不同来源茶薪菇多糖在同一浓度时，来源于子实体的多糖还原力最强，其次为菌丝体多糖，发酵液多糖还原力最弱；且来源于子实体的多糖还原力远强于来源于菌丝体与发酵液的多糖。在不同来源茶薪菇多糖的清除羟自由基能力测定中，随着多糖浓度的增高，来源于子实体，菌丝体，发酵液的多糖清除羟自由基能力逐渐增高；来源于茶薪菇子实体的多糖清除羟自由基能力最强，且远高于来源于发酵液及菌丝体的多糖；当多糖浓度为0.25mg/ml时，来源于菌丝体和发酵液多糖的清除羟自由基能力相差不大，当大于0.25mg/ml时，随着多糖浓度升高，发酵液的多糖清除羟自由基能力明显大于菌丝体的。不同来源茶薪菇多糖清除超氧阴离子自由基能力测定中，随着多糖浓度的增高，来源于子实体，菌丝体，发酵液的多糖清除超氧阴离子自由基能力逐渐增高；三种不同来源茶薪菇多糖在同一浓度时，来源于子实体多糖清除能力最强，其次为发酵液多糖，菌丝体多糖最弱。参考文献1 汤 俊，胡征宇.3种念珠藻多糖对自由基的清除作用J.武汉植物学研究，2006, 24(1) : 6366 2 盛 伟，吴 萍，方晓阳.白灵菇、杏鲍菇、阿魏菇多糖体外抗氧化活性研究J.安徽科技学院生命科学学院，2008，29（05）：1031093 秦恩华.茶新菇水溶性多糖的提取及其对氧自由基清除效果的研究J.现代食品科技,2007，23（06)：44494 杨 玲,汪河滨,罗 锋.甘草多糖清除自由基活性的研究J.塔里木大学学报，2007，19(01)：135 薛丁萍,魏玉西,刘 淇，等.浒苔多糖对羟自由基的清除作用研究J.海洋科学，2010,34（01）：44466 颜 军，郭晓强，邬晓勇，等.银耳多糖的提取及其清除自由基作用J.成都大学学报，2006，25（01）：35387 李海平，张树海，张坤生.滑菇多糖抗氧化活性研究J.食品研究与开发，2008，29（4）：148 郑 琳，蒲 训，毕玉蓉.白阿魏侧耳子实体抗氧化活性的研究J.中国食用菌，2002，22（1）：23269 王宗君，廖丹葵，张良军.茶树菇多糖提取工艺研究J.广州化工，2009，37（7）：919310 胡晓倩，唐洪华，程安阳.茶树菇多糖提取价钱抗氧化性能研究J.湖北农业科学，2011，50（21）：4465446811 鄢 嫣，张 汇，聂少平，等.黑灵芝子实体水溶性多糖的理化性质及抗氧化活性的研究J.食品科学，2009，30（19）：556012 方 飞，唐志红.海蒿子多糖的抗氧化活性研究J.安徽农业科学，2011,39(16):9590959113 许海顺，蒋剑平，徐 攀，等.红参多糖抗氧化活性的研究J.浙江中医药大学学报，2011，35（6）：90991214 慧和平，封士兰，胡芳弟，等.红芪多糖的体外抗氧化活性研究J.安徽农业科学，2010，38（8）：4056405715 许 平.黄瓜多糖抗氧化活性研究J.重庆工商大学学报，2009,26(1)：545616 张志军，李淑芳，魏雪生.灵芝多糖体外抗氧化活性的研究J.化学与生物工程，2011，28（1）：6365 致谢大学四年的生活即将去逝，回想大学伊始，无聊而又无奈；可现在，却又依依不舍。回望过去，无论是失败还是成功，那些美好的经历都会成为我以后学习和成长的动力。这些日子里，备受老师、朋友以及同学的关爱，我在快乐中成长与进步。首先要深深感谢我的导师解春艳老师，尽管她身体不适，依旧尽心尽力地帮我，在她的精心指导下，我顺利的完成了实验。老师广博的科学知识，严谨的科学作风，积极的科研态度，勇于开拓的科研精神对我产生了深远影响；使我发自内心的喜欢上了科学研究。我从老师身上学到了积极进取，认真严谨，一丝不苟的科研精神。以及为人处事中要平易近人。这将是我终生受益。十分感谢老师在我实验中给予的帮助和关心。在实验过程中，我要特别感谢我的一些朋友。杨江涛、李亚、雷云龙同学给予我很大的帮助，在这里我要深深地感谢你们，感谢你们在我实验中给我的关怀和鼓励，尤其是江涛同学，给了我很多示范与讲解。这样的深情厚谊，我将铭记于心。要特别感谢的是我的父母和哥哥，每当我遇到困难，想退缩时，他们真切交谈，给了我动力和激情，才使得我的大学生活充满乐趣，圆满结束。我取得的每一点成绩都凝集着他们的心血，他们对我的期望和支持，我将永生不忘。最后，谨向所有给予我关怀、帮助、指导的师长、同学表示最真挚的谢意！