备课素材：融合PCR 高二下学期生物人教版选择性必修3.docx

融合PCR先看一道试题：融合PCR技术是采用具有互补末端的引物，将不同来源的扩增片段连接起来构建融合基因的方法，其过程如下图1所示。将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，再将该融合基因转入小鼠细胞内，表达出的蛋白质就会带有绿色荧光如图2所示 （1）图1第一阶段中PCR至少进行_次循环，才能获得双链等长的DNA，第二阶段中引物2与引物3部分碱基的_关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。（2）若通过融合PCR技术将启动子、目的基因、终止子拼接起来，需要设计_种引物，其中能够起着“搭桥”作用的引物有_种。（3）图1所示的第二阶段的2次PCR应该分别如何选择引物？请填写以下表格（若选用该引物划“”，若不选用该引物则划“×”）。引物1引物2引物3引物4PCR1PCR2（4）绿色荧光蛋白在图2研究中的主要作用是（_）A追踪目的基因在细胞内的复制过程B追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布C追踪目的基因插入到染色体上的位置D追踪目的基因编码的蛋白质的空间结构（5）图2中载体上的Neo基因是一种抗生素抗性基因，图中步骤所用的G418是一种抗生素(对细胞有毒害作用)，添加G418的目的是_。（6）图2中步骤要将细胞注射入图中囊胚的_位置。（7）图中所用的胚胎干细胞在形态上具有_的特性（8）图2中分娩出的小鼠C所有体细胞中的核基因_（是/否）相同。【答案】（1）2    互补配对    （2）6    4（3）（4）B   （5）筛选出导入目的基因的胚胎干细胞  （6）内细胞团  （7）细胞体积小，细胞核大，核仁明显  （8）否【解析】（1）DNA分子具有半保留复制的特点，通过画简图可推知图1第一阶段中PCR至少进行2次循环，才能获得双链等长的DNA；第二阶段中引物2与引物3部分碱基的互补配对关系使得两DNA能成功“搭桥”连接起来。（2）若通过融合PCR技术将启动子、目的基因、终止子拼接起来，启动子与目的基因连接需要2种引物，同样目的基因和终止子连接也需要2种引物，同时在搭建而成的长的DNA分子的两端各需要1种引物，所以最终需要设计12216种引物，其中两端的2种引物不能起“搭桥'的作用，因此能够起着“搭桥”作用的引物有624种。（3）根据题意和图解可知，引物2与引物3部分碱基具有互补配对关系，使得两DNA能成功“搭桥”连接起来，故PCR1不再另外需要引物即可完成；PCR2是AB基因融合后，进行的PCR扩增，需要引物1和引物4。（4）将绿色荧光蛋白基因的片段与目的基因连接起来组成一个融合基因，将该融合基因转入小鼠细胞内，表达出的蛋白质带有绿色荧光，从而可以追踪目的基因编码的蛋白质在细胞内的分布，故B项正确，A、C、D项错误。（5）图2中载体上的Neo基因（一种抗生素抗性基因）相当于标记基因，图中步骤添加G418（对细胞有毒害作用）的目的是筛选出导入目的基因的胚胎干细胞。（6）图2中步骤要将细胞注射入图中囊胚的内细胞团（将来发育成胎儿的各种组织）位置。（7）胚胎干细胞在形态上具有细胞体积小、细胞核大、核仁明显的特性。（8）据图2可知，小鼠C中只有后来转入到囊胚中的部分转基因胚胎干细胞发育成的组织细胞内含有融合基因，而受体囊胚中其他内细胞团细胞发育而成的组织细胞内没有融合基因，故图2中分娩出的小鼠C所有体细胞中的核基因不相同。这道试题以融合PCR为情境考查PCR技术、基因工程、胚胎工程。那么，什么是融合PCR技术?一什么是融合PCR技术：融合PCR技术(fusion PCR)采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。传统的融合基因重组构建是以限制性内切酶和DNA连接酶为基础，即通过限制酶将两个DNA分子进行酶切后，用连接酶将两个具有相同末端酶切位点的DNA片段进行连接。这不仅需要对DNA片段的限制酶切位点有所了解，而且对于过片段连接有时很难找到合适的内切酶对DNA片段进行酶切，对于过短的片段又增加了连接和鉴定的难度，同时在连接过程中还引入了不必要的酶切位点碱基序列，因此，在某种程度上限制了该方法的应用。二融合PCR技术的原理：通过在上游引物的 5端添加一段帽子序列,这 段帽子序列与靶 1 序列同源;而此引物的 3端序列与靶 2 序列同源。这样,在第一个 PCR 反应中,以靶 2 序列为模板,使靶 2 序列得到扩增,而 扩增产物均携带与靶 1 序列同源或互补的序列。然后,以这样的扩增产物为引物,在第二个 PCR 反应中,以靶 1 序列为模板,使靶 1 序列得到扩增。这样得到的产物既含有靶 1 序列,又含有靶靶 2 序列。三融合PCR技术的操作步骤：1.引物设计：需要将A片段的3端引物含有B片段的一部分，B片段的5端引物含有A片段的一部分，这样分别扩增获得A和B就含有了互补片段。如图中第一步中的P2含有一部分B片段序列，P3含有A片段一部分序列2.分别PCR扩增A和B片段，25L体系一次扩增8管含有一管阴性对照，切胶回收这两个片段。如上图第一步，单独扩增A和B片段3.以A和B两个片段为模板，进行融合PCR实验。融合PCR分为两步，操作步骤如下：第一步：（不加引物）循环参数：95预变性 5min，94变性 20s、57退火 20s、72延伸 40s 进行 10个循环，72延伸 5min。如上图第二步：（第一步不需要添加引物，因为让A和B片段具有互补片段，可以互为引物扩增）4.第二步：10个循环后，取出反应管加入引物。循环参数：95预变性 5min，94变性 20s、60退火 20s、72延伸 40s 进行 10个循环，72延伸 5min。待反应完毕后，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 产物。如上图第三步融合PCR应用实例：以大肠杆菌质粒Y1（含SII基因）和质粒Y2（含SIII基因）为模板，以SII基因和SIII基因为目标基因，通过融合PCR技术获得SII+SIII融合基因。说明（1）PCR过程需要4种引物，分别为g1、g2、g3、g4（2）引物g1和g2以SII基因为模板，引物g3和g4以SII基因为模板（3）引物g2的5端含有一段与引物g3的3端一段碱基互补的序列（4）引物g3的5端含有一段与引物g2的3端一段碱基互补的序列说明（1）第一次5个循环需要4种引物（2）第二次5个循环不需要引物，以第一次扩增获得的两个片段互为模板和引物（3）第三次30个循环需要2种引物，即引物g1和引物g4 例、融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。其原理如下图所示，据图分析正确的是（    ） A上述过程中使用的引物P2和P3的碱基需要完全互补配对B融合PCR的第一步是不需要引物的，可能是因为两条链重叠部位互为另一条链的引物C融合PCR的第一步需要加入耐高温DNA聚酶和DNA连接酶等D若融合PCR的第二步获得64个融合基因，理论上该过程消耗了128个引物  答案：B学科网（北京）股份有限公司学科网（北京）股份有限公司学科网（北京）股份有限公司