外周血单个核细胞的分离9451.docx

实验二十四 外周血单个核细胞的分离  (Separation of mononuclear cell in peripheral blood)    免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别。外周血单个核细胞(PBMC)的分离主要有两种方法，即聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶(Percoll)分离法。此处只介绍聚蔗糖-泛影葡胺分离法。【实验原理】血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖(Ficoll)和泛影葡胺(Hypaque) 按一定比例混合制成，20密度为1.077±0.001，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其密度为1.0501.077，而粒细胞和红细胞的密度为1.0801.110。将待分离的细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上，经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面，而红细胞与粒细胞沉于管底。【主要试剂和器材】1.聚蔗糖-泛影葡胺分层液  密度为1.077±0.001。2.5g/L台盼蓝。3.250U/ml肝素溶液  用Hank,s液配制。4.Hank,s液。5.注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。6.水平离心机、显微镜。【操作方法】1.抽取静脉血2ml，注入含有0.2ml肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再加入等量Hank,s液混匀。2.取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2131为宜。3.置水平离心机中，2000r/min离心20min。4.离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。6.加入4倍量以上的Hank,s液，充分混匀，1000rmin离心l0min。离心后倾弃上清液，再用Hank,s液洗2次。7.用含10%20%灭活小牛血清的Hank,s液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。【结果判断】 【注意事项】1.将血液进行稀释可降低血液黏稠度和红细胞的聚集，提高单个核细胞的收获量。2.温度变化可直接影响分层液的密度，即影响细胞的收获率和纯度。故应在室温(1825)下进行实验，分层液使用前应预温至室温。温度过低，淋巴细胞丢失增多；温度过高，会影响淋巴细胞活性。3.分离时的转速与时间应根据不同样品作相应调整。离心速度在20002500r/min，离心时间为l520min，离心后若见白雾状细胞层中仍掺杂红细胞，应提高转速或延长离心时间，若淋巴细胞丢失过多，则应适当降低转速或离心时间。4.分层液应直接加入管底，防止浸沾四周管壁。5.将细胞悬液叠加于分层液上时务必小心，不要扰乱界面以影响分离效果。6.充分冼涤分离后的单核细胞，可除去大部分混杂的血小板。【应用与评价】 本方法操作简便、稳定。细胞回收率达80%90%，单个核细胞纯度可达95%，淋巴细胞约占90%95%，细胞活力可达95%以上。但其中仍可混杂少量(约10%)其它细胞。该方法是目前最理想、最常用分离淋巴细胞的手段，其制备的细胞(主要是淋巴细胞)悬液已能满足许多细胞免疫试验要求，也可用于进一步制备T细胞、B细胞及单核细胞。故在细胞免疫试验中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的技术之一。【思考题】1.为何常用密度为1.077土0.001的分层液分离人单个核细胞？2.利用密度梯度离心法分离人单个细胞，为何要将血液样品进行适当稀释，并要叠加于分层液上？外周血单个核细胞的分离密度梯度离心法一、原理根据物理学中颗粒沉降原理，不同密度的物质颗粒在其沉降运动中可因其比重的差别而处于不同的分布位置。利用此原理可设计一定比重的液体界面，将外周血中各种不同比重的细胞通过离心沉降而达到使其彼此分离的目的。已知人类淋巴细胞和单核细胞的比重大约在1.0751.090之间，而红细胞与粒细胞的比重均大于1.090。因此，若用比重为1.077±0.001的分离液则可通过密度梯度离心方法，在分离液界面上收集外周血单个核细胞。 二、器材与试剂器材：（1）水平式离心机（2）显微镜（3）血球计数板、血盖片（4）载玻片、盖玻片（5）定量移液器、洗耳球（6）刻度离心管（7）试管、滴管、橡皮滴头（8）小滤纸、擦镜纸 试剂：（1）抗凝全血（临时抽取）、40倍稀释的全血（计数用）（2）淋巴细胞分离液（市售，比重：1.077±0.001）（3）Hanks液（4）白细胞稀释液（5）0.5%锥兰生理盐水溶液 三、操作步骤在已含1ml抗凝全血的试管内加入1ml Hanks液，混匀，然后用滴管将此稀释全血沿盛有1ml淋巴细胞分离液的试管壁轻轻铺于分离液面上。将该试管置水平式离心机中离心（2000rpm）20分钟。用计数板在显微镜下计数40倍稀释的全血，计算出其中的白细胞总数（/ml）及单个核细胞总数（/ml）。离心后的外周血各成份在试管中的分布位置如下图：用滴管小心地直接插入白色絮状的细胞层（含单个核细胞），吸出界面层细胞，移入刻度离心管内。在该细胞收集管内（即刻度离心管）加入Hanks液，用滴管轻轻上下冲洗混匀，然后在离心（1000rpm）10分钟，弃去上清液，将沉淀细胞充分摇匀，再用Hanks液洗涤2次。用0.5ml Hanks液将沉淀细胞稀释，摇匀。取细胞悬液一滴加入等量白细胞稀释液于另一试管中充分混匀，用计数板在显微镜下计数，计算出白细胞总数（/ml）及单个核细胞数（/ml）。检查细胞活力：取细胞悬液一滴加入等量锥兰溶液于另一试管中充分混匀，用载玻片在显微镜下计数100200个单个核细胞中着色的死细胞数。 四、操作注意事项注意分离液与稀释血的比例，一般以1:21:3为宜。分离时所取的离心速度与时间，因各台离心机的离心半径而异，需事先通过预试验决定。加入稀释血时应十分小心，注意保护试管内的界面，勿使混淆影响分离效果。做细胞活力检查时，锥兰染色后应尽快计数完毕，时间过长则细胞活力可能降低。 五、实验结果记录与分析通过前后两次细胞计数：计算细胞回收率（%）  分离后单个核细胞总数×100%分离前单个核细胞总数 计算单个核细胞纯度（%）分离后单个核细胞总数×100% 分离后白细胞总数 计算细胞活力（%）分离后活细胞数×100%分离后细胞总数外周血单个核细胞分离技术：1、采取外周静脉血3ml，抗凝方法采用玻璃珠摇动法（这样的话血小板不会和PBMC混的太多）2、采用3ml N-S 或Hanks 液做对倍稀释处理，即总体积为6ml3、取一中试管，加入2ml的淋巴细胞分离液，尔后，将6ml稀释过的全血小心加到分离液的上表面，尤其在刚开始加的时候，动作一定要慢、轻柔，后面就可以加快速度，最总使得分离液和血液的比例为1：3，分离液界面保持清楚！4、离心，2000rpm ，20min，后吸取PBMC5、洗涤，将放有PBMC的离心管用N-S 充盈至10ml，混匀，2000rpm，10min，再重复两次，但均为1000rpm，10min，即可得到PBMC,加培基后即可保存供实验用！用ficoll分：测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞。(一)原理:常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是 1.077±0.001 的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(FH)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，犌W水性高，平均分子量为400,000，当密度为1.2gml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。(二)方法:1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。5.末次离心后，弃上清，加入含有10小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。单个核细胞浓度(细胞数1毫升细胞悬液)4个大方格内细胞总数×10×2(稀释倍数)46.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。活细胞数活细胞百分率×100总细胞数用本法分离PBMC，纯度在90以上，收获率可达8090，活细胞百分率在95以上。(三)试剂和材料:比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。Hank's液(无Ca、Mg)10小牛血清RPMI16400.2台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。肝素用Hank's液或生理盐水稀释成500单位ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位1毫升血。短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。无菌干燥注射器针头。碘酒，75酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。血球计数板、显微镜、水平式离心机。(四)注意事项:1.抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。2.操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。3.用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。4.小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同，犛配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。(五)附录1.Hank's液(无Ca、Mg)配制法NaCl 8.0克KCl 0.4克NaHPO·12HO 0.12克KHHPO0.06克葡萄糖1.0克双蒸水 1000毫克1酚红液 2毫克将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4冰箱保存，临用时调PH至7.37.6。2.细胞分层液配制法9聚蔗糖24份34泛影葡胺 10混合，测比重为1.0771.078，G玻璃滤器过滤除菌。冰箱保存备用。3.磷酸缓冲液原液:A液: 0.2M NaHPO溶液 NaHPO27.6克或NaHPO·2HO 31.2克蒸馏水溶解至1000毫升B液：0.2M HaHPO溶液 HaHPO·12HO 71.6克蒸馏水溶解至1000毫升各种不同PH值PB的配法PH7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0A液(ml) 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.5B液(ml) 61.0 72.0 81.0 87.0 91.0 94.5举例: 0.1MPH7.2PBA液28毫升B液72毫升加蒸馏水 100ml4.血球保存液葡萄糖2.05克枸椽酸钠0.8克氯化钠0.42克蒸馏水 100毫升将上述成分混匀，略加温使其溶解，分装小瓶(100毫升)。经10磅、10分钟高压灭菌。4保存备用。5.RPMI-1640培养液:RPMT-1640(FLOW公司出品)1袋三蒸水 1000毫升电磁搅拌30分钟：1NHCl调PH7.27.4(约加2.5毫升)，过滤除菌，作无菌试验，4保存。不完全RPMI-1640培养液:RPMI-164095毫升0.1M丙酮酸钠1毫升 0.2M谷氨酰胺 1毫升1MHepes 1毫升7.5 NaHCO 1毫升青霉素、链霉素(各1万单位)1毫升完全RPMI-1640培养液不完全1640培养液90毫升灭活胎牛(或新生牛)血清 10毫升聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 【试剂及配制】（1）     聚蔗糖-泛影葡胺分层液：有成品供应，比重为1.077±0.0001。（2）     台盼蓝染液：称取4g台盼蓝，于研钵中用少量双蒸水研磨，加双蒸水至100ml，1500r/min 离心15min，吸取上层液，即为4%水溶液。用前，用1.8%氯化钠溶液稀释1倍，即为2%台盼蓝染液。（3）     HBSS或RPMI-1640液【操作方法】（1）     采集静脉血若干ml(随需要而定),注入盛有肝素的无菌小瓶中(每1ml全血用0.1ml 125250U/ml肝素溶液抗凝),加盖后立即轻轻摇匀,使血液抗凝；（2）     用吸管加入等体积的室温HBSS或PBS,使血液等倍稀释,可降低红细胞的凝聚,提高分离效果（此步骤亦可省去）；（3）     吸取淋巴细胞分层液(每10ml稀释血加5ml分层液)置于15ml或50ml离心管中,然后将离心管倾斜45°角,将稀释血液在距分层液界面上1cm处沿试管壁缓慢加至分层液上面(亦可将吸管嘴插入离心管底部,将分层液缓慢加在稀释血液的下面),应注意保持两者界面清晰,勿使血液混入分层液内；（4）     将离心管置水平式离心机内,在1820下,以2，000r/min离心20min。离心后,管内可分为以下四层:上层为血浆、血液稀释液及绝大部分血小板；下层为红细胞及粒细胞；中层为细胞分层液；分层液与血浆交界部位混浊的灰白色层即为单个核细胞层。见图1。Ficoll-Hypaque离心法分离血液成分 （5）     用毛细吸管轻轻插入灰白色层,沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞,盛入另一支离心管中;或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板,再用另一支毛细吸管仔细吸取单个核细胞。既要尽量吸取所有单个核细胞,又要避免吸取过多的分层液或血浆,以免混入其他细胞成分；（6）     将所得到的PBMC悬液用5倍体积的HBSS或RPMI-1640洗涤2次,依次以2，000r/min、1500r/min在室温下(1825)离心10min,可去掉大部分混杂的血小板；（7）     用完全RPMI-1640定容细胞,计数细胞后再调整细胞所需浓度。一般每ml健康成人血可分离出1×1062×106个单个核细胞；（8）     用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性:取2滴细胞悬液加1滴2台盼蓝染液,510min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色,死细胞染成蓝色。计数200个细胞,计算活细胞百分率,一般活性应在95以上。【注意事项】（1）     与血液样品接触时应注意生物安全防护,避免血源性传染病。 （2）     操作应轻柔,细胞悬液应充分混匀,避免损伤细胞活性及细胞丢失。   （3）     细胞分层液的密度是影响分离效果的关键之一,最适密度在室温下应为1.077±0.001g/L;应避光4下保存,取出后逐渐升至室温后混匀,方可使用;使用中应避免细菌污染。（4）     稀释血液可降低红细胞的凝聚,提高淋巴细胞收获量,但如果要保留血浆成分作其它实验用时,则不能稀释血液,以免影响血浆成分。（5）     离心时的温度对分离效果亦有影响,温度过低,离心时间需适当延长,淋巴细胞丢失增多;温度过高,增加红细胞凝聚,且影响淋巴细胞活性.离心时最适温度为1820。（6）     若从未抗凝血中分离单个核细胞,可先用链激酶溶解血凝块,然后再按上述方法分离。（7）     分离组织中的单个核细胞亦可采用上述方法。 内容总结（1）实验二十四 外周血单个核细胞的分离  (Separation of mononuclear cell in peripheral blood)    免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括T、B淋巴细胞、NK细胞、单核细胞/巨噬细胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞表面的分子标志等均存在差异，借助这些差异可区分不同的细胞类别