β内酰胺类抗生素高分子杂质测定法课件.ppt

-内酰胺类抗内酰胺类抗生素高分子杂生素高分子杂质测定法质测定法5/29/20231 第一节 -内酰胺类抗生素中的高分子杂质v一、定义一、定义-内酰胺类抗生素（内酰胺类抗生素（-lactamantibiotics）系指）系指化学结构中具有化学结构中具有-内酰胺环的一大类抗生素，包括内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素（临床最常用的青霉素（penicillins）与头孢菌素）与头孢菌素（cephalosporin），以及近年开发的头霉素类、），以及近年开发的头霉素类、硫霉素类、单环硫霉素类、单环-内酰胺类等其他非典型内酰胺类等其他非典型-内酰胺内酰胺类抗生素。类抗生素。系对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。系对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。其分子量一般在其分子量一般在10005000，个别可至约，个别可至约10000道道尔顿，小于化工、生化领域中所指的高分子化合物尔顿，小于化工、生化领域中所指的高分子化合物的分子量。的分子量。5/29/20232-内酰胺类抗生素中的高分子杂质v二、分类及来源二、分类及来源按其来源分为两类：外源性杂质和内源性按其来源分为两类：外源性杂质和内源性杂质。杂质。外源性杂质：包括外源性杂质：包括蛋白蛋白、多肽多肽、多糖等类、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物。一般来源于发酵工艺，如青霉素中的青物。一般来源于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。5/29/20233v内源性杂质：抗菌药物自身聚合产物。聚合内源性杂质：抗菌药物自身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又可在储存中形成，物即可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时使用不当也可产生。甚至在用药时使用不当也可产生。v抗生素聚合物的抗生素聚合物的免疫原性免疫原性通常较弱，但作为通常较弱，但作为多价多价半抗原半抗原，可引发，可引发速发型过敏反应速发型过敏反应。免疫原性免疫原性(immunogenicity)：抗原刺激机体产生免：抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力。疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力。抗原性抗原性(antigenicity)：抗原与其诱生的抗体或致：抗原与其诱生的抗体或致敏淋巴细胞有特异性结合的能力。也写作反应原性。敏淋巴细胞有特异性结合的能力。也写作反应原性。完全抗原：同时具备完全抗原：同时具备2个性质。天然的蛋白质都是完个性质。天然的蛋白质都是完全抗原。全抗原。半抗原半抗原(hapten)：只有抗原性而没有免疫原性的物质，：只有抗原性而没有免疫原性的物质，即只能与抗体结合，却不能单独诱导抗体产生的物质，即只能与抗体结合，却不能单独诱导抗体产生的物质，称为半抗原。一般分子量较小，如化学药物。半抗原称为半抗原。一般分子量较小，如化学药物。半抗原+载体载体(carrier)完全抗原完全抗原。速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。敏反应以及过敏性休克。随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中外源性杂质日趋减少，对产品中外源性杂质日趋减少，对内源性聚合内源性聚合物物的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。的重点。5/29/20234图1 水温引起阿莫西林干糖浆中高分子杂质含量的变化5/29/20235-内酰胺类抗生素中的高分子杂质v三、形成机理及结构特征三、形成机理及结构特征v（一）青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白（多肽）（一）青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白（多肽）类杂质和聚合物杂质两大类。类杂质和聚合物杂质两大类。5/29/20236v青霉噻唑多肽：青霉噻唑多肽：制剂中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在制剂中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在35002400道尔顿左右，有青霉素的道尔顿左右，有青霉素的-内酰内酰胺环和多肽的伯氨基按亲核反应机理胺环和多肽的伯氨基按亲核反应机理缩合缩合而而成，主要发生在成，主要发生在发酵工艺发酵工艺中。样品在储存过中。样品在储存过程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍与程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍与-内内酰胺反应，直至被饱和，反应速度和样品本酰胺反应，直至被饱和，反应速度和样品本身的身的水分含量水分含量及及储存温度储存温度有关。有关。5/29/20237青霉噻唑蛋白的基本结构青霉噻唑蛋白的基本结构青霉素青霉素G内酰胺环断裂点内酰胺环断裂点5/29/20238v青霉素聚合物：青霉素聚合物：1.反应仅和母核结构有关，侧链中的活性基反应仅和母核结构有关，侧链中的活性基团不参与反应。团不参与反应。一分子青霉素首先开环，形成一新的活性一分子青霉素首先开环，形成一新的活性位点，并与另一分子青霉素聚合。位点，并与另一分子青霉素聚合。2.侧链参与的聚合反应侧链参与的聚合反应主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上的氨基亲核攻击的氨基亲核攻击-内酰胺抗生素的内酰胺抗生素的羰基碳原羰基碳原子子，形成聚合物。，形成聚合物。5/29/20239v头孢菌素：头孢菌素中的高分子杂质主要是头孢菌素：头孢菌素中的高分子杂质主要是不同类型的聚合物。不同类型的聚合物。1.只与母核结构有关的只与母核结构有关的N型聚合反应型聚合反应eg.头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等2.侧链参与的侧链参与的L型聚合反应。型聚合反应。eg.头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等在碱性条件下，两种反应都可以发生。在碱性条件下，两种反应都可以发生。5/29/202310-内酰胺类抗生素中的高分子杂质内酰胺类抗生素中的高分子杂质v四、结构特点四、结构特点高度的不均一性和不确定性。高度的不均一性和不确定性。1.青霉噻唑多肽（蛋白）类杂质青霉噻唑多肽（蛋白）类杂质发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片都可能发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片都可能带入到产品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可带入到产品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子。以结合不同数目的药物分子。5/29/202311v2.聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不仅能聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不仅能形成聚合度不同的聚合物，许多样品还能同形成聚合度不同的聚合物，许多样品还能同时发生时发生不同机理不同机理的聚合反应。的聚合反应。v3.形成的聚合物可发生不同程度的分（降）形成的聚合物可发生不同程度的分（降）解反应，如开环等。解反应，如开环等。v4.对以异构体形式存在的样品，同聚和异聚对以异构体形式存在的样品，同聚和异聚反应可同时发生。反应可同时发生。v5.实践中发现高分子杂质的种类及数量和实践中发现高分子杂质的种类及数量和生生产工艺产工艺密切相关，如氨苄西林钠，溶媒法和密切相关，如氨苄西林钠，溶媒法和喷雾干燥法的高分子杂质具有不同的特异性，喷雾干燥法的高分子杂质具有不同的特异性，且二者的聚合物含量明显不同。且二者的聚合物含量明显不同。冻干粉冻干粉二聚物二聚物溶媒粉溶媒粉二聚物二聚物5/29/202312-内酰胺类抗生素中的高分子杂质内酰胺类抗生素中的高分子杂质v五、影响聚合物形成的因素五、影响聚合物形成的因素1.青霉素的聚合物青霉素的聚合物青霉素的聚合反应速度在溶液条件下和溶青霉素的聚合反应速度在溶液条件下和溶液的液的酸碱度酸碱度关系密切；在固体条件下主要和关系密切；在固体条件下主要和样品的样品的水分含量水分含量有关。有关。5/29/202313v2.头孢菌素的聚合物头孢菌素的聚合物固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含含水量水量和和贮存温度贮存温度的关系密切。的关系密切。贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至上升至37时，含水量差异对聚合物含量的时，含水量差异对聚合物含量的影响十分显著。影响十分显著。5/29/202314-内酰胺类抗生素中的高分子杂质v六、口服青霉素类药物使用前进行皮试的必六、口服青霉素类药物使用前进行皮试的必要性要性口服青霉素类抗生素在国内外均有过敏反口服青霉素类抗生素在国内外均有过敏反应报道，但其原因未有试验报道。有相关报应报道，但其原因未有试验报道。有相关报道，在青霉素道，在青霉素V聚合物可经胃肠道吸收而引发聚合物可经胃肠道吸收而引发过敏反应。因此，在口服青霉素类抗生素前，过敏反应。因此，在口服青霉素类抗生素前，必须进行皮肤过敏试验，这是十分必要的。必须进行皮肤过敏试验，这是十分必要的。5/29/202315-内酰胺类抗生素中的高分子杂质内酰胺类抗生素中的高分子杂质v七、抗生素高分子杂质的质控意义七、抗生素高分子杂质的质控意义1.-内酰胺类抗生素中的高分子杂质是引发内酰胺类抗生素中的高分子杂质是引发临床临床速发型过敏反应速发型过敏反应的过敏原；的过敏原；2.高分子杂质经注射和口服都可引起过敏反高分子杂质经注射和口服都可引起过敏反应，因此注射剂和口服剂都应控制。应，因此注射剂和口服剂都应控制。3.高分子杂质是高分子杂质是-内酰胺类抗生素质量评价内酰胺类抗生素质量评价的重要指标，可评价药品质量和稳定性，并的重要指标，可评价药品质量和稳定性，并可借此进一步评价其生产工艺。可借此进一步评价其生产工艺。5/29/202316第二节第二节高分子杂质分析方法高分子杂质分析方法高分子杂质质控方法高分子杂质质控方法化学分析化学分析免疫学分析免疫学分析色谱法色谱法分光法（分光法（P值法）值法）间接血凝法间接血凝法豚鼠豚鼠PCA法法反相模式反相模式离子交换模式离子交换模式凝胶色谱模式凝胶色谱模式一、概述一、概述5/29/202317v由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生物学特性，如：均为过敏性杂质，因此，在物学特性，如：均为过敏性杂质，因此，在药物质量控制中一般药物质量控制中一般不需不需分别控制不同结构分别控制不同结构的高分子杂质含量，而只需控制药品中高分的高分子杂质含量，而只需控制药品中高分子杂质的子杂质的总量总量。故根据。故根据分子量差异分子量差异进行分离进行分离的的凝胶色谱模式凝胶色谱模式是简便易行的分离模式。是简便易行的分离模式。v以葡聚糖凝胶以葡聚糖凝胶SephadexG-10为基础的凝胶为基础的凝胶色谱分析方法，可简便地用于对各种色谱分析方法，可简便地用于对各种-内酰内酰胺类抗生素中的高分子杂质的分离、分析，胺类抗生素中的高分子杂质的分离、分析，并满足药品质量控制的需要。并满足药品质量控制的需要。5/29/202318高分子杂质分析方法高分子杂质分析方法v二、凝胶色谱系统的分离原理及特点二、凝胶色谱系统的分离原理及特点5/29/202319凝胶色谱系统的分离原理及特点凝胶色谱系统的分离原理及特点v1.凝胶色谱法凝胶色谱法凝胶色谱法又称凝胶色谱法又称分子排阻色谱法分子排阻色谱法。凝胶色。凝胶色谱法主要用于谱法主要用于高聚物高聚物的相对分子质量分级分的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法析以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要设备简单、操作方便，不需要有机溶剂有机溶剂，对，对高分子物质有很高的分离效果。它是利用某高分子物质有很高的分离效果。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。滞作用也不同而进行分离、分析的方法。5/29/202320凝胶色谱系统的分离原理及特点凝胶色谱系统的分离原理及特点v2.凝胶色谱系统的分离原理凝胶色谱系统的分离原理（1）利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的）利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而埃。让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分子杂质具有相同的保留时间的设想。高分子杂质具有相同的保留时间的设想。5/29/202321凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图5/29/202322v凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以这种物质可以完全或部分完全或部分排阻某些排阻某些大分子化大分子化合物合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。透。v任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用程度可用分配系数分配系数Kav（被分离化合物在内（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。水和外水体积中的比例关系）表示。5/29/202323v实验证明，实验证明，SephadexG-10凝胶可基本保凝胶可基本保证所有的证所有的-内酰胺抗生素中的高分子杂质被内酰胺抗生素中的高分子杂质被排阻。排阻。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav:分配系数；分配系数；Ve：被分离物质洗脱体积；：被分离物质洗脱体积；Vo：柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有的体：柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有的体积（外水体积）；积（外水体积）；Vt：柱内凝胶颗粒占有的体积与外水体积之和：柱内凝胶颗粒占有的体积与外水体积之和（柱床体积）（柱床体积）一般一般Kav0洗脱的组分视作高分子杂质。洗脱的组分视作高分子杂质。5/29/202324外水体积（外水体积（Vo）：凝胶柱中凝胶颗粒周：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即液体流动相体积；围空间的体积，即液体流动相体积；内水体积（内水体积（Vi）：凝胶颗粒中孔穴的体：凝胶颗粒中孔穴的体积，即固定相体积；积，即固定相体积；基质体积（基质体积（Vg）：凝胶颗粒实际骨架体：凝胶颗粒实际骨架体积。积。Vt=Vo+Vi+Vg柱床体积（柱床体积（Vt）：凝胶柱：凝胶柱所能容纳的总体积所能容纳的总体积5/29/202325洗脱体积（洗脱体积（Ve）：将样品中某一组分洗脱：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。下来所需洗脱液的体积。一般是介于一般是介于Vo和和Vt之间的。之间的。（1）对于完全排阻的大分子，由于其不进）对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故故Ve=Vo；（2）对于完全渗透的小分子，由于可以存）对于完全渗透的小分子，由于可以存在于凝胶柱整个体积内，故在于凝胶柱整个体积内，故Ve=Vt；分子量介于两者之间的分子，其洗脱体分子量介于两者之间的分子，其洗脱体积也介于两者之间，但，有时也出现积也介于两者之间，但，有时也出现VeVt，这是由于这种分子与凝胶的吸附作用，这是由于这种分子与凝胶的吸附作用造成的。造成的。5/29/202326凝胶层析洗脱示意图凝胶层析洗脱示意图（1）完全排阻的大分子）完全排阻的大分子（2）中等分子）中等分子（3）完全渗透的小分子）完全渗透的小分子（4）吸附分子）吸附分子5/29/202327v通常选用蓝色葡聚糖通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（光光度仪检测（210nm或或260nm或或620nm）洗脱体积（即洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用以有时用巨球巨球蛋白蛋白代替。代替。5/29/202328Vo的测定的测定5/29/202329Vt的测定的测定5/29/202330v（2）由于溶质分子和凝胶介质间存在多种次）由于溶质分子和凝胶介质间存在多种次级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质的表面。的表面。v（3）在凝胶颗粒内部具有较大的比表面积和）在凝胶颗粒内部具有较大的比表面积和较小的自由空间，故溶质分子更易和凝胶介较小的自由空间，故溶质分子更易和凝胶介质接触，因此溶质分子在质接触，因此溶质分子在凝胶颗粒内部凝胶颗粒内部较较凝凝胶颗粒外部胶颗粒外部更易被吸附。更易被吸附。v（4）即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝）即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝胶对胶对药物分子药物分子的吸附作用的吸附作用大于大于对对高分子杂质高分子杂质的吸附作用。的吸附作用。5/29/202331有目的的利用药物分子和凝胶间的次级相互有目的的利用药物分子和凝胶间的次级相互作用，使药物分子吸附于凝胶颗粒内表面，作用，使药物分子吸附于凝胶颗粒内表面，进而改善高分子杂质和药物分子之间的分离进而改善高分子杂质和药物分子之间的分离度。度。v（5）在深入研究药物和葡聚糖凝胶的相互作）在深入研究药物和葡聚糖凝胶的相互作用及流动相对该相互作用的影响的基础，通用及流动相对该相互作用的影响的基础，通过调节色谱过程中的过调节色谱过程中的流动相组成、浓度、流动相组成、浓度、pH和流速和流速等参数，调节药物分子和凝胶颗粒间等参数，调节药物分子和凝胶颗粒间的相互作用，进而调节高分子杂质和药物分的相互作用，进而调节高分子杂质和药物分子间的分离度。子间的分离度。5/29/202332凝胶色谱系统的分离原理及特点凝胶色谱系统的分离原理及特点v3.SephadexG-10凝胶色谱法分离凝胶色谱法分离-内酰胺内酰胺抗生素中高分子杂质的概况：抗生素中高分子杂质的概况：在在SephadexG-10凝胶色谱系统中，理论凝胶色谱系统中，理论上上-内酰胺抗生素三聚体以上的高分子杂质内酰胺抗生素三聚体以上的高分子杂质均集中在均集中在Kav=0的色谱峰中；调节各种色谱的色谱峰中；调节各种色谱条件，既可使条件，既可使-内酰胺抗生素的寡聚物（如内酰胺抗生素的寡聚物（如青霉素类抗生素的二聚物等）和其它高分子青霉素类抗生素的二聚物等）和其它高分子杂质分离，又可使其二者合二为一，因此可杂质分离，又可使其二者合二为一，因此可用于不同的分析目的。用于不同的分析目的。5/29/202333高分子杂质分析方法高分子杂质分析方法v三、色谱条件对三、色谱条件对-内酰胺类抗生素在内酰胺类抗生素在SephadexG-10凝胶色谱系统中色谱行凝胶色谱系统中色谱行为的影响为的影响5/29/202334色谱条件的影响色谱条件的影响v1.流动相离子强度对溶质保留行为的影响：流动相离子强度对溶质保留行为的影响：流动相的离子强度和色谱行为虽然并无直流动相的离子强度和色谱行为虽然并无直接联系，但一般说来，当流动相中的离子种接联系，但一般说来，当流动相中的离子种类不改变时，离子强度越大，类不改变时，离子强度越大，-内酰胺类抗内酰胺类抗生素的生素的Kav值越大。值越大。5/29/202335v在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。v有研究表明，在流动相中添加有研究表明，在流动相中添加中性盐中性盐如氯化如氯化钠或钠或增加增加缓冲液的浓度后缓冲液的浓度后，均使离子强度增均使离子强度增加，使加，使-内酰胺类抗生素中的高分子杂质得内酰胺类抗生素中的高分子杂质得到有效分离。到有效分离。5/29/202336色谱条件的影响色谱条件的影响v2.流动相种类对溶质色谱行为的影响：流动相种类对溶质色谱行为的影响：常用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓常用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。改变流动相中缓冲液的种类，可以改变溶改变流动相中缓冲液的种类，可以改变溶质的色谱行为，对质的色谱行为，对-内酰胺类抗生素，表现内酰胺类抗生素，表现为其为其Kav值的改变及色谱峰型的变化。值的改变及色谱峰型的变化。5/29/202337流动相流动相0.1mol/L头孢菌素的头孢菌素的Kav值值头孢他啶头孢他啶头孢曲松头孢曲松头孢噻吩头孢噻吩柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液0.452.522.06硫酸铵硫酸铵0.361.761.45磷酸缓冲液磷酸缓冲液0.311.361.42醋酸缓冲液醋酸缓冲液0.270.791.00碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液0.210.550.88硝酸钠硝酸钠0.150.210.58流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为的影响流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为的影响5/29/202338测定次数测定次数缓冲盐缓冲盐0.1mol/L理论板数理论板数拖尾因子拖尾因子1磷酸缓冲液磷酸缓冲液31911.43柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液23852.542磷酸缓冲液磷酸缓冲液41211.43柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液31202.40流动相对头孢他啶高分子杂质色谱行为的影响流动相对头孢他啶高分子杂质色谱行为的影响5/29/202339v分析证明，影响这种变化的决定因素是缓冲分析证明，影响这种变化的决定因素是缓冲液中的液中的阴离子种类阴离子种类，阴离子所带的负电荷越，阴离子所带的负电荷越多，溶质的多，溶质的Kav值相对越大，色谱峰也越易值相对越大，色谱峰也越易拖尾。拖尾。5/29/202340色谱条件的影响色谱条件的影响v3.流动相流动相pH的影响的影响对于弱酸，流动相的对于弱酸，流动相的pHpH值越小，组分的值越小，组分的k k值越值越大，当大，当pHpH值远远小于弱酸的值远远小于弱酸的pKapKa值时，弱酸主值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。当流动相中有多元酸当流动相中有多元酸/盐存在时，盐存在时，pH通过影通过影响多元酸的解离，改变缓冲液中的阴离子类响多元酸的解离，改变缓冲液中的阴离子类型，来改变溶质的保留时间。型，来改变溶质的保留时间。5/29/202341色谱条件的影响色谱条件的影响v4.洗脱速度的影响洗脱速度的影响流速越大，溶质的保留值减小。反之，溶流速越大，溶质的保留值减小。反之，溶质的保留值增大。质的保留值增大。这是由于流速较快时，溶质分子进入凝胶这是由于流速较快时，溶质分子进入凝胶颗粒内部的概率减小，导致与葡聚糖凝胶相颗粒内部的概率减小，导致与葡聚糖凝胶相互作用的机会减少之故。互作用的机会减少之故。5/29/202342色谱条件的影响色谱条件的影响v5.溶质保留值和半峰宽的关系溶质保留值和半峰宽的关系-内酰胺抗生素在内酰胺抗生素在SephadexG-10凝胶色凝胶色谱系统中的半峰宽与其保留时间均呈线性关谱系统中的半峰宽与其保留时间均呈线性关系。也就是说，保留时间越大，半峰宽越大，系。也就是说，保留时间越大，半峰宽越大，峰型越难看。峰型越难看。5/29/202343第三节第三节分子排阻色谱法分子排阻色谱法v中国药典中国药典2005版二部规定，版二部规定，分子排阻色谱法分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术，其分离原理即为凝胶色谱柱液相色谱技术，其分离原理即为凝胶色谱柱的分子筛机制。的分子筛机制。-内酰胺类抗生素中的高分内酰胺类抗生素中的高分子杂质的测定采用分子排阻色谱法。子杂质的测定采用分子排阻色谱法。5/29/202344自身对照外标法自身对照外标法v原理原理在在SephadexG-10凝胶色谱系统中，由凝胶色谱系统中，由于于SephadexG-10的排阻分子量仅为的排阻分子量仅为700道道尔顿，因此，除部分寡聚物外，尔顿，因此，除部分寡聚物外，-内酰胺抗内酰胺抗生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留；生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留；即所有高分子杂质表现为单一的色谱峰，其即所有高分子杂质表现为单一的色谱峰，其kav=0。5/29/202345自身对照外标法自身对照外标法v在特定条件下，在特定条件下，-内酰胺抗生素由于分子间内酰胺抗生素由于分子间的氢键、静电、疏水相互作用等次级相互作的氢键、静电、疏水相互作用等次级相互作用，可以形成用，可以形成缔合物缔合物，导致其表观分子量增，导致其表观分子量增大。此时，在大。此时，在SephadexG-10凝胶色谱系统凝胶色谱系统中和高分子杂质具有相似的色谱行为，即在中和高分子杂质具有相似的色谱行为，即在kav=0处表现为单一的色谱峰。处表现为单一的色谱峰。5/29/202346自身对照外标法自身对照外标法v测定方法测定方法利用以上所述原理，在利用以上所述原理，在SephadexG-10凝胶凝胶色谱系统中，以药物自身为对照品，测定其色谱系统中，以药物自身为对照品，测定其在特定条件下在特定条件下缔合时的峰缔合时的峰响应指标；再改变响应指标；再改变色谱条件，测定样品高分子杂质和药物分离色谱条件，测定样品高分子杂质和药物分离后，后，kav=0处处高分子杂质的峰高分子杂质的峰响应指标；按响应指标；按外标法计算，既得药品中高分子杂质相当于外标法计算，既得药品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。药品本身的相对含量。流动相流动相B：水：水流动相流动相A：磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液5/29/202347v为什么采用自身对照外标法？为什么采用自身对照外标法？定量分析法的理论基础：通过检测器的物定量分析法的理论基础：通过检测器的物质的量与检测器的响应信号成正比，其检测质的量与检测器的响应信号成正比，其检测器响应可以是面积或峰高。器响应可以是面积或峰高。含含量量响响应应值值(A或或H)定量方法：定量方法：外标法外标法内标法内标法峰面积归一法峰面积归一法主成分对照法主成分对照法5/29/202348v 1.外标法外标法以以待测物质的对照品待测物质的对照品为参照物，根据供试为参照物，根据供试品的量和对照品的量以及对应的响应信号进品的量和对照品的量以及对应的响应信号进行定量的方法。行定量的方法。高聚物对照品较难制备，即使制备的高聚高聚物对照品较难制备，即使制备的高聚物对照品由于不稳定也较难保存，而且不同物对照品由于不稳定也较难保存，而且不同批制备的对照品很难同质。批制备的对照品很难同质。-内酰胺抗生素高分子杂质具有高度的不内酰胺抗生素高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性。均一性和不确定性。5/29/202349v2.归一化法归一化法将测得色谱图上，将测得色谱图上，所有色谱峰所有色谱峰面积求和，面积求和，与每个色谱峰面积相比较，即得每个色谱峰与每个色谱峰面积相比较，即得每个色谱峰的百分比，把所有的色谱峰的百分比相加即的百分比，把所有的色谱峰的百分比相加即得得100%，称为峰面积归一化。，称为峰面积归一化。对于高分子杂质来说，其含量和药物本身对于高分子杂质来说，其含量和药物本身含量相差甚远，测量误差较大。含量相差甚远，测量误差较大。5/29/202350高分子高分子杂质杂质样品主峰样品主峰5/29/202351v3.内标法内标法内标法是结合了峰面积归一法和外标法内标法是结合了峰面积归一法和外标法的优点的一种方法，它在加入内标后，按峰的优点的一种方法，它在加入内标后，按峰面积归一法的分析方法进行分析，这就避免面积归一法的分析方法进行分析，这就避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的偶然误差，因而，它的分析精密度也是比较偶然误差，因而，它的分析精密度也是比较高的，是气相色谱的一种比较理想的定量分高的，是气相色谱的一种比较理想的定量分析方法。析方法。5/29/202352v4.主成分对照法主成分对照法由于由于SephadexG-10凝胶色谱分离系凝胶色谱分离系统的柱效较低，进样微量的药物很难表现统的柱效较低，进样微量的药物很难表现出色谱峰。出色谱峰。5/29/202353基本分析方法基本分析方法5/29/202354仪仪器器v1.恒流泵恒流泵1）转速转速范围：）转速转速范围：0.1-120rpm,正反转可逆正反转可逆2）调速方式：无级调速配）调速方式：无级调速配以线性数码旋钮连续可调以线性数码旋钮连续可调3）速度分辩率：）速度分辩率：30rpm以以下为下为0.1rpm，30rpm以上以上为为1rpmv硅胶管硅胶管1）粗细合适）粗细合适2）壁厚）壁厚1.5mm3）耐磨）耐磨5/29/202355仪仪器器v2.玻璃层析柱玻璃层析柱合理选择层析柱的长度和合理选择层析柱的长度和直径，是保证分离效果的直径，是保证分离效果的重要环节，理想的层析柱重要环节，理想的层析柱的直径与长度之比一般为的直径与长度之比一般为1：251：100.5/29/202356仪仪器器v3.检测器检测器-内酰胺抗生素通常都内酰胺抗生素通常都有较明显的紫外吸收特有较明显的紫外吸收特征，所以测定中一般选征，所以测定中一般选择紫外检测器，通常用择紫外检测器，通常用到的检测波长是到的检测波长是254nm。5/29/202357仪仪器器v3.数据处理系统数据处理系统积分仪积分仪n选择性记录选择性记录,n进行积分处进行积分处理和定量计理和定量计算算色谱工作站色谱工作站u色谱控制色谱控制数据采集数据采集记录记录计算计算分析分析图谱保存图谱保存实验结果实验结果编排编排打印于一体打印于一体5/29/202358v系统适用性试验系统适用性试验1.以蓝色葡聚糖以蓝色葡聚糖2000的保留时间来表示高分的保留时间来表示高分子杂质的保留特征，考察对照品色谱峰及高子杂质的保留特征，考察对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖2000溶液色谱溶液色谱峰保留时间的比值均应不超过某一限度。峰保留时间的比值均应不超过某一限度。中国药典要求是中国药典要求是0.931.07。对照品峰和供试品溶液聚合物峰与相应色对照品峰和供试品溶液聚合物峰与相应色谱中蓝色葡聚糖谱中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值也峰的保留时间的比值也是是0.931.07。5/29/202359流动相流动相A：磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液流动相流动相B：水：水5.3495.1865/29/202360v2.理论板数理论板数在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖2000峰计算，理论板数均峰计算，理论板数均不小于不小于700。5/29/202361v3.拖尾因子拖尾因子在两种流动相系统在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖中，按蓝色葡聚糖2000峰计算，拖尾峰计算，拖尾因子均因子均小于小于2.0。5/29/2023624.重复性重复性RSD考察对照品在流动相考察对照品在流动相B系统中重复进样系统中重复进样后峰面积的相对标准偏差应符合规定。后峰面积的相对标准偏差应符合规定。5/29/202363v流动相流动相B：水：水测定对照品，在测定对照品，在Kav=0处表现为单一的处表现为单一的色谱峰，以药物自身为对照品，测定这一色谱峰，以药物自身为对照品，测定这一条件下缔合时的峰响应指标。条件下缔合时的峰响应指标。5.305测定过程测定过程5/29/202364v流动相流动相A：磷酸盐缓冲液：磷酸盐缓冲液测定供试品，测定样品中高分子杂质和药测定供试品，测定样品中高分子杂质和药物分离后，物分离后，Kav=0处高分子杂质的峰响应指处高分子杂质的峰响应指标。标。5.3455/29/202365影响准确测定的若干因素影响准确测定的若干因素v1.峰响应值的选择峰响应值的选择v2.检测器类型及其线性范围检测器类型及其线性范围v3.进样量的影响进样量的影响v4.对照品异质性的影响对照品异质性的影响5/29/202366分离度分离度v定义：分离度是指高分子聚合物与药物单体定义：分离度是指高分子聚合物与药物单体之间分离程度（或分离能力）。之间分离程度（或分离能力）。Hp Hp 次高峰到基线的高。次高峰到基线的高。HvHv 次高峰与最大峰曲线次高峰与最大峰曲线分离的最低点到基线的高。分离的最低点到基线的高。5/29/202367分离度影响因素分离度影响因素v1.凝胶对药物吸附作用的强弱与结构有关凝胶对药物吸附作用的强弱与结构有关v2.与洗脱剂组成有关与洗脱剂组成有关v3.与流动相的离子强度有关与流动相的离子强度有关v4.与流动相的与流动相的pH有关有关v5.与流动相的流速有关与流动相的流速有关5/29/202368第四节第四节SephadexG-10凝胶色谱系凝胶色谱系统有关的实验技术统有关的实验技术v1.凝胶的预处理凝胶的预处理凝胶：凝胶：溶胶溶胶或或溶液溶液中的中的胶体胶体粒子或粒子或高分子高分子在一在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的中充满了作为分散介质的液体液体（在干凝胶中也可以（在干凝胶中也可以是是气体气体），这样一种特殊的），这样一种特殊的分散体系分散体系称作凝胶。没称作凝胶。没有有流动性流动性。内部常含有大量液体。葡聚糖凝胶属于。内部常含有大量液体。葡聚糖凝胶属于弹性凝胶弹性凝胶弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新而当重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀膨胀。5/29/202369v凝胶粒度的选择：凝胶粒度的选择：一般来说，细颗粒分离效果好，但流速一般来说，细颗粒分离效果好，但流速慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使洗脱峰变平而宽。因此，如用细颗粒凝胶宜洗脱峰变平而宽。因此，如用细颗粒凝胶宜用大直径的层析柱，用粗颗粒时用小直径的用大直径的层析柱，用粗颗粒时用小直径的层析柱。在实际操作中，要根据工作需要，层析柱。在实际操作中，要根据工作需要，选择选择适当的颗粒大小适当的颗粒大小并调整流速。并调整流速。5/29/202370v凝胶溶胀方法：凝胶溶胀方法：称取葡聚糖凝胶，缓慢地倾倒入称取葡聚糖凝胶，缓慢地倾倒入510倍倍的的去离子水中去离子水中或或蒸馏水蒸馏水，搅拌均匀，在室温，搅拌均匀，在室温溶胀溶胀6小时，或小时，或沸水浴溶胀沸水浴溶胀2小时小时，一般采用，一般采用后一种方法（能除去凝胶中污染的细菌，同后一种方法（能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡）时排除气泡）。再用倾泻法除去凝胶上层水。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，最后及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，最后减压抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，准备装减压抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，准备装柱。柱。商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。理，根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的水量的2倍，例如倍，例如SephadexG-20的吸水量的吸水量为为20，1克克SephadexG20吸水后形成的吸水后形成的凝胶体积约凝胶体积约40ml。5/29/202371v凝胶再生：凝胶再生：对于不锈钢色谱柱对于不锈钢色谱柱其方法是其方法是:先用水反复进行逆向先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分析。冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分析。对于玻璃层析柱对于玻璃层析柱其方法是：将凝胶从柱柱中取出，其方法是：将凝胶从柱柱中取出，将已使用过的凝胶先用将已使用过的凝胶先用0.2mol/L氢氧化钠与氢氧化钠与0.2mol/L氯化钠混合液浸泡半小时后，用水