(1)--DNA生物合成分子生物学.ppt
DNA的生物合成DNA Biosynthesis(Replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。n复制的概念复制亲代DNA子代DNA复制的基本特征 DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。n半保留复制AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA 复制过程中形成的复制叉子代DNA 子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 密度梯度实验 实验结果支持半保留复制的设想含重氮-DNA的细菌培养于普通培养液 第一代继续培养于普通培养液 第二代梯度离心结果按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。n半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。n双向复制复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterA B C真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。53oriorioriori535533553复制子3复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向35335领头链(leading strand)随从链(lagging strand)顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。DNA复制的酶学n参与DNA复制的物质 底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子复制的化学反应(dNMP)n+dNTP (dNMP)n+1+PPi DNA 新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿5 3方向进行。聚合反应的特点全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)简称：DNA-polnDNA聚合酶活性：53 的聚合活性 核酸外切酶活性5 A G C T T C A G G A T A 3|3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性 5 3 外切酶活性?能切除突变的 DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性 n原核生物的DNA聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol n原核生物的DNA聚合酶功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中 出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）323个氨基酸5 核酸外切酶活性604个氨基酸DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性N 端C 端木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。大片段/Klenow 片段 小片段DNA-pol（120kD）DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。功能：是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA-pol (250kD)n真核生物的DNA聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 真核生物的DNA聚合酶n复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读（二）复制的保真性和碱基选择（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。（二）复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制 n复制中的分子解链及DNA 分子拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白E.Coli 基因图解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整 1010 8 8 局部解链后DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)解链过程中正超螺旋的形成拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶 拓扑异构酶分 类拓扑异构酶切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。n作用机制 DNA连接酶连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNA ligase)作用方式HO5335DNA连接酶ATPADP5353DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。n功能DNA复制的基本过程（一）复制的起始需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。n原核生物的DNA生物合成 E.coli复制起始点 oriC1.DNA解链2.引发体和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。引物引物3 HO5引物酶引物酶n复制的延长复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol领头链的合成随从链的合成随从链的合成阶段一阶段二阶段三阶段四复复制制过过程程简简图图原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。n复制的终止555RNA酶OHP5DNA-pol dNTP55PATP ADP+Pi55DNA连接酶 随从链上不连续性片段的连接n真核生物的DNA生物合成 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。（一）复制的起始3 5 5 3 领头链3 5 3 5 亲代DNA随从链引物核小体（二）复制的延长染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。（三）复制的终止切除引物的两种机制切除引物的两种机制端粒(telomere)指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。功能 维持染色体的稳定性 维持DNA复制的完整性结构特点 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短 序列。TTTTGGGGTTTTGGGG端粒酶(telomerase)端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR)端粒酶协同蛋白(human telomerase associated protein 1,hTP1)端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTRT)组成端粒酶的催化延长作用爬行模型DNA聚合酶复制子链进一步加工逆转录和其他复制方式逆转录酶(reverse transcriptase)逆转录(reverse transcription)一、逆转录病毒和逆转录酶 逆转录逆转录酶酶逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板逆转录酶DNA-RNA 杂化双链RNA酶单链DNA逆转录酶双链DNA逆转录酶 A AA A T T T TAAAASI核酸酶 DNA聚合酶碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。试管内合成cDNAcDNA complementary DNA二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。滚环复制(rolling circle replication)三、滚环复制和D环复制 是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。滚环复制dNTPDNA-pol D环复制(D-loop replication)是线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式。DNA损伤与修复遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础 二、引发突变的因素物理因素 紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射 UV化学因素三、突变的分子改变类型错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement)框移(frame-shift)DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。2.颠换（一）错配镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人Hb(HbA)亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因（二）缺失、插入和框移缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。缺失或插入都可导致框移突变。谷谷 酪酪 蛋蛋 丝丝5 G C A G U A C A U G U C 丙丙 缬缬 组组 缬缬正常5 G A G U A C A U G U C 缺失C缺失引起框移突变（三）重排DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。由基因重排引起的两种地中海贫血基因型四、DNA损伤的修复修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。光修复(light repairing)切除修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复 修复的主要类型（一）光修复光修复酶(photolyase)UVUvrAUvrBUvrCOHPDNA聚合酶聚合酶OHP（二）切除修复是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。DNA连接酶连接酶ATPE.coli的切除的切除修复机制修复机制（三）重组修复（四）SOS修复当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子(regulon)的网络式调控系统。这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。谢谢 谢谢
