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一基因工程的诞生一基因工程的诞生（）基因工程的别名基因工程的别名基因拼接技术或基因拼接技术或DNADNA重组技术重组技术操作环境操作环境生物体外生物体外操作对象操作对象基因基因操作水平操作水平DNADNA分子水平分子水平基本过程基本过程剪切剪切拼接拼接导入导入表达表达结果结果人类需要的基因产物人类需要的基因产物一一基因工程的理论基础基因工程的理论基础1基因拼接基因拼接的理论基础的理论基础:不同生物不同生物DNA的化学组成的化学组成和结构相同和结构相同(1)DNA是生物的主要遗传物质；是生物的主要遗传物质；(2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸；(3)双链双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋。分子的空间结构都是规则的双螺旋。2外源基因在受体内外源基因在受体内表达表达的理论基础的理论基础:所有生物共所有生物共用一套遗传密码子用一套遗传密码子(1)基因是控制生物性状的基本单位，具有独立性；基因是控制生物性状的基本单位，具有独立性；(2)遗传信息的传递都遵循中心法则所阐述的信息遗传信息的传递都遵循中心法则所阐述的信息流动方向；流动方向；(3)生物界共用一套密码子。生物界共用一套密码子。二基因工程的原理及技术二基因工程的原理及技术（）二二DNA重组技术的基本工具重组技术的基本工具1限制性内切酶限制性内切酶(1)来源：主要从原核生物中分离。来源：主要从原核生物中分离。(2)功能：能够识别双链功能：能够识别双链DNA分子的某种特定分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(3)切割后的末端有黏性末端和平末端两种。切割后的末端有黏性末端和平末端两种。2DNA连接酶连接酶(1)功能：将切下来的功能：将切下来的DNA片段拼接成新的片段拼接成新的DNA分子。分子。(2)分类：分类：E.coliDNA连接酶和连接酶和T4DNA连接酶。连接酶。(3)作用位点：两个核苷酸之间的磷酸二酯键。作用位点：两个核苷酸之间的磷酸二酯键。E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。和平末端被切开的磷酸二酯键。比较与比较与DNA有关的酶有关的酶（1）DNA水解酶：能够将水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基。苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基。（2）DNA解旋酶：能够将解旋酶：能够将DNA或或DNA的某一段解的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如外，在适当的高温（如94）、重金属盐的作用下，）、重金属盐的作用下，也可使也可使DNA解旋（解旋（PCR技术）。技术）。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成酯键连接成DNA长链。长链。（4）限制性内切酶：）限制性内切酶：（5）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较的缺口。注意比较DNA聚合酶和聚合酶和DNA连接酶连接酶的异同点。的异同点。补充：补充：DNA连接酶与连接酶与DNA聚合酶的比较聚合酶的比较DNA连连接接酶酶DNA聚合聚合酶酶成分成分蛋白蛋白质质作用部位作用部位催化形成磷酸二催化形成磷酸二酯键酯键作用作用过过程程将将DNA片段的末片段的末端端连连接起来接起来将将单单个脱氧核苷个脱氧核苷酸酸连连接成接成DNA长长链链作用作用结结果果将存在的将存在的DNA片片段段连连接成重接成重组组DNA形成新形成新DNA分子分子(1)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已聚合酶只能将单个脱氧核苷酸加到已有的脱氧核苷酸片段的有的脱氧核苷酸片段的3末端的羟基上，形末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。片段之间形成磷酸二酯键。(2)DNA聚合酶是以一条聚合酶是以一条DNA链为模板，将单链为模板，将单个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的板链互补的DNA链；而链；而DNA连接酶是将连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，因此，双链上的两个缺口同时连接起来，因此，DNA连接酶不需要模板。连接酶不需要模板。补充：限制酶和补充：限制酶和DNA连接酶的区别与联系连接酶的区别与联系限制限制酶酶DNA连连接接酶酶作用作用切割目的基因或切割目的基因或载载体体将两个将两个DNA片段片段连连接接作用作用对对象象及效果及效果都作用于磷酸二都作用于磷酸二酯键酯键，与，与氢键氢键无关，但无关，但作用效果相反作用效果相反酶酶的特性的特性有催化作用，可重复利用，受温度、有催化作用，可重复利用，受温度、pH等影响等影响3基因进入受体细胞的载体基因进入受体细胞的载体(1)载体种类：质粒、载体种类：质粒、噬菌体的衍生物、动噬菌体的衍生物、动植物病毒，最常用的载体是质粒。植物病毒，最常用的载体是质粒。(2)条件：能在宿主细胞中保存下来并大量复条件：能在宿主细胞中保存下来并大量复制；有一个至多个限制酶切割点以供外源制；有一个至多个限制酶切割点以供外源DNA插入；有特殊的遗传标记基因，便于筛插入；有特殊的遗传标记基因，便于筛选。选。补充：载体的特点及作用补充：载体的特点及作用(1)一般来说，天然载体往往不能同时具备载体必一般来说，天然载体往往不能同时具备载体必须具备的条件，所以在基因工程中需要根据不同的须具备的条件，所以在基因工程中需要根据不同的需要，对载体进行人工改建。现在所使用的质粒载需要，对载体进行人工改建。现在所使用的质粒载体几乎都是经过改建的。体几乎都是经过改建的。(2)作为载体必须具有多个限制酶切点，而且每种作为载体必须具有多个限制酶切点，而且每种酶的切点最好只有一个。因为某种限制性内切酶只酶的切点最好只有一个。因为某种限制性内切酶只能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，能识别单一切点，若载体上有一个以上的酶切点，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。复制起点区，则进入受体细胞后便不能自主复制。(3)大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等细菌中都大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等细菌中都有质粒。它存在于细菌的细胞质中，上面一般含几有质粒。它存在于细菌的细胞质中，上面一般含几个到几百个基因，控制着细菌的抗药性、固氮、抗个到几百个基因，控制着细菌的抗药性、固氮、抗生素合成等性状。由于土壤农杆菌很容易感染植物生素合成等性状。由于土壤农杆菌很容易感染植物细胞，使细胞生有瘤状物。所以科学家培育转基因细胞，使细胞生有瘤状物。所以科学家培育转基因植物时，常常用土壤农杆菌中的质粒做载体。植物时，常常用土壤农杆菌中的质粒做载体。(4)注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质注意与细胞膜上载体的区别，两者的化学本质和作用都不相同。和作用都不相同。三基因工程的基本操作程序三基因工程的基本操作程序1目的基因的获取目的基因的获取2基因表达载体的构建基因表达载体的构建（基因工程的核心）（基因工程的核心）3将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞4目的基因的检测和鉴定目的基因的检测和鉴定1目的基因的获取：从目的基因的获取：从基因文库基因文库中获取；利用中获取；利用PCR技术扩增技术扩增目的基因；人工合成，常用的方法目的基因；人工合成，常用的方法是是反转录法反转录法和和化学合成法化学合成法。补充：原核细胞、真核细胞基因结构的比较补充：原核细胞、真核细胞基因结构的比较原核原核细细胞的基因胞的基因真核真核细细胞的基因胞的基因区区别别点点编码编码区区连续连续编码编码区区间间隔、不隔、不连连续续结结构构简单简单结结构复构复杂杂相同相同点点都有都有编码编码区、非区、非编码编码区，在非区，在非编码编码区都有区都有调调控控遗传遗传信息表达的核苷酸序列，在信息表达的核苷酸序列，在编码编码区上游均有与区上游均有与RNA聚合聚合酶酶结结合的位点合的位点补充：补充：PCR技术技术请回答基因工程方面的有关问题：请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。复制类似（如下图所示）。图中引物为单链图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。片段，它是子链合成延伸的基础。从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的的DNA片段所占的比例为片段所占的比例为。在第在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的链等长的DNA片段。片段。(2)设计引物是设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。（如下图），请分别说明理由。第第1组：组：；第第2组：组：。2基因表达载体的构建基因表达载体的构建(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。作用。(2)组成：组成：目的基因；目的基因；启动子：位于基因的首端，是启动子：位于基因的首端，是RNA聚合酶识别聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录出和结合的部位，驱动基因转录出mRNA；终止子：位于基因的尾端，使转录停止；终止子：位于基因的尾端，使转录停止；标记基因：鉴别受体细胞中是否含目的基因。标记基因：鉴别受体细胞中是否含目的基因。补充：终止子位于基因的末端，使转录停止。终止补充：终止子位于基因的末端，使转录停止。终止密码位于密码位于mRNA上，使翻译终止。上，使翻译终止。3将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞生物生物种种类类植物植物细细胞胞动动物物细细胞胞微生物微生物细细胞胞常用常用方法方法农农杆菌杆菌转转化法、化法、基因基因枪枪法、花法、花粉管通道法粉管通道法显显微注射微注射技技术术感受感受态细态细胞胞法法受体受体细细胞胞体体细细胞胞受精卵受精卵原核原核细细胞胞生物生物种种类类植物植物细细胞胞动动物物细细胞胞微生物微生物细细胞胞转转化化过过程程目的基因插目的基因插入植物入植物细细胞胞中染色体的中染色体的DNA上上进进入入农农杆菌杆菌导导入植物入植物细细胞胞稳稳定定维维持和表达持和表达目的基因目的基因表达表达载载体体提提纯纯取取受精卵受精卵显显微注射微注射受精卵受精卵移植移植新新性状性状动动物物首先用首先用Ca2处处理大理大肠肠杆杆菌菌细细胞，使胞，使细细胞壁的通透胞壁的通透性增大，性增大，细细胞胞处处于一种能于一种能吸收周吸收周围环围环境中境中DNA分子分子的生理状的生理状态态，这这种种细细胞称胞称为为感受感受态细态细胞。第二步是胞。第二步是将重将重组组表达表达载载体体DNA分子分子溶于溶于缓缓冲液中与感受冲液中与感受态细态细胞混合，在一定温度下促胞混合，在一定温度下促进进感受感受态细态细胞吸收胞吸收DNA分分子，完成子，完成转转化化过过程程4目的基因的检测和鉴定目的基因的检测和鉴定类类型型步步骤骤检测检测内容内容方法方法结结果果分子分子检测检测第一步第一步目的基因是目的基因是否否进进入受体入受体细细胞胞DNA分子分子杂杂交交(DNA和和DNA之之间间)是否成是否成功功显显示示出出杂杂交交带带第二步第二步目的基因是目的基因是否否转录转录出信出信使使RNADNA分子分子杂杂交技交技术术(DNA和和RNA之之间间)第三步第三步目的基因是目的基因是否翻否翻译译出蛋出蛋白白质质抗原抗原抗体抗体杂杂交方法交方法个体个体水平水平检测检测包括抗虫、抗病的接种包括抗虫、抗病的接种实验实验，以确定是否有抗，以确定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程性以及抗性的程度；基因工程产产品与天然品与天然产产品品的活性比的活性比较较，以确定功能是否相同等，以确定功能是否相同等三基因工程的应用（三基因工程的应用（）转转基因生物基因生物目的基因目的基因成果成果举举例例植植物物基基因因工工程程抗虫抗虫转转基基因植物因植物抗虫基因：抗虫基因：Bt毒蛋白基因、毒蛋白基因、蛋白蛋白酶酶抑制抑制剂剂基因、淀粉基因、淀粉酶酶抑抑制制剂剂基因、植物凝集素基因基因、植物凝集素基因抗虫水稻、抗虫棉、抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米抗虫玉米抗病抗病转转基基因植物因植物抗病毒基因：病毒外壳蛋白基抗病毒基因：病毒外壳蛋白基因、病毒的复制因、病毒的复制酶酶基因；抗真基因；抗真菌基因：几丁菌基因：几丁质质酶酶基因、抗毒基因、抗毒素合成基因素合成基因抗病毒烟草、抗病抗病毒烟草、抗病毒小麦、抗病毒番毒小麦、抗病毒番茄、抗病毒甜椒茄、抗病毒甜椒抗逆抗逆转转基基因植物因植物抗逆基因：渗透抗逆基因：渗透压调节压调节基因、基因、抗抗冻冻蛋白基因、抗除草蛋白基因、抗除草剂剂基因基因抗抗盐盐碱和抗干旱的碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、烟草、抗寒番茄、抗除草抗除草剂剂的大豆和的大豆和玉米玉米改良品改良品质质的的转转基因植物基因植物优优良性状基因：提高必需氨基良性状基因：提高必需氨基酸含量的蛋白酸含量的蛋白质编码质编码基因、控基因、控制番茄成熟的基因、与花青素制番茄成熟的基因、与花青素代代谢谢有关的基因有关的基因高高赖赖氨酸玉米、耐氨酸玉米、耐储储存番茄、新花色存番茄、新花色矮矮牵牵牛牛转转基因生物基因生物目的基因目的基因成果成果举举例例动动物物基因基因工程工程提高生提高生长长速度速度的的转转基因基因动动物物外源生外源生长长激素基因激素基因转转基因基因绵绵羊、羊、转转基因基因鲤鱼鲤鱼生生产药产药物的物的转转基因基因动动物物药药用蛋白基因乳腺蛋白用蛋白基因乳腺蛋白基因的启基因的启动动子子乳腺生物反乳腺生物反应应器器改善畜改善畜产产品品品品质质的的转转基因基因动动物物肠肠乳糖乳糖酶酶基因基因乳汁中含乳糖乳汁中含乳糖较较少的少的转转基因牛基因牛作器官移植供作器官移植供体的体的转转基因基因动动物物外源的抗原决定基因表达外源的抗原决定基因表达的的调节调节因子或除去供体的因子或除去供体的抗原决定基因抗原决定基因利用克隆技利用克隆技术术培培育没有免疫排斥育没有免疫排斥反反应应的猪器官的猪器官基因基因治治疗疗体外基因治体外基因治疗疗腺苷酸脱氨腺苷酸脱氨酶酶基因基因治治疗疗复合型免疫复合型免疫缺陷症缺陷症体内基因治体内基因治疗疗治治疗疗囊性囊性纤维纤维化病基因化病基因治治疗遗传疗遗传性囊性性囊性纤维纤维化病化病补充：补充：动物基因工程主要为了改善畜产品的品质，动物基因工程主要为了改善畜产品的品质，不是为了产生体型巨大的个体。不是为了产生体型巨大的个体。基因治疗目前只是处于初期的临床试验阶段，在基因治疗目前只是处于初期的临床试验阶段，在临床上未开展、未实现这方面的治疗。临床上未开展、未实现这方面的治疗。DNA分子制作探针进行检测时应检测单链，即分子制作探针进行检测时应检测单链，即将双链将双链DNA分子打开。分子打开。Bt毒蛋白基因产生的毒蛋白基因产生的Bt毒蛋白并无毒性，进入毒蛋白并无毒性，进入昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。昆虫消化道被分解成多肽后产生毒性。青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程生产青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程生产的。的。四蛋白质工程四蛋白质工程（）蛋白质工程与基因工程比较蛋白质工程与基因工程比较项项目目蛋白蛋白质质工程工程基因工程基因工程区区别别原理原理 中心法中心法则则的逆推的逆推基因重基因重组组项项目目蛋白蛋白质质工程工程基因工程基因工程过过程程预预期蛋白期蛋白质质功能功能设设计计蛋白蛋白质结质结构构推推测测氨基酸序列氨基酸序列推推测测脱脱氧核苷酸序列氧核苷酸序列合成合成DNA表达出蛋白表达出蛋白质质获获取目的基因取目的基因构建表达构建表达载载体体导导入受体入受体细细胞胞目的基目的基因的因的检测检测与与鉴鉴定定实质实质定向改造或生定向改造或生产产人人类类所需蛋白所需蛋白质质定向改造生物的定向改造生物的遗传遗传特性，特性，以以获获得人得人类类所需的生物所需的生物类类型型或生物或生物产产品品(基因的异体表基因的异体表达达)结结果果生生产产自然界没有的蛋自然界没有的蛋白白质质生生产产自然界中已有的蛋白自然界中已有的蛋白质质联联系系蛋白蛋白质质工程是在基因工程的基工程是在基因工程的基础础上延伸出来的第二上延伸出来的第二代基因工程，因代基因工程，因为对现为对现有蛋白有蛋白质质的改造或制造新的的改造或制造新的蛋白蛋白质质，必，必须须通通过过基因修基因修饰饰或基因合成或基因合成实现实现1下列对基因工程的理解，正确的是下列对基因工程的理解，正确的是()可按照人们的意愿，定向改造生物遗传特性的工程可按照人们的意愿，定向改造生物遗传特性的工程对基因进行人为删减或增添某些碱基对基因进行人为删减或增添某些碱基是体外进行的人为的基因重组是体外进行的人为的基因重组在实验室内，利用相关的酶和原料合成在实验室内，利用相关的酶和原料合成DNA主要技术为体外主要技术为体外DNA重组技术和转基因技术重组技术和转基因技术在在DNA分子水平上进行操作分子水平上进行操作一旦成功，便可遗传一旦成功，便可遗传ABC DC解析：解析：一旦成功，便可遗传一旦成功，便可遗传因为基因工程一般是将外源基因与载体连接因为基因工程一般是将外源基因与载体连接导入受体细胞中，导入受体细胞中，载体有自我复制功能载体有自我复制功能，或，或者者能将目的基因整合到细胞自身的能将目的基因整合到细胞自身的DNA上上，这样细胞进行分裂的时候目的基因也会随质这样细胞进行分裂的时候目的基因也会随质粒复制或者是细胞染色体粒复制或者是细胞染色体DNA复制而复制，复制而复制，是可遗传。是可遗传。判断正误判断正误质粒通常存在于细菌体内，目前尚未发现真质粒通常存在于细菌体内，目前尚未发现真核生物体内有类似的结构核生物体内有类似的结构若要获得真核生物的目的基因，则一般采用若要获得真核生物的目的基因，则一般采用人工合成方法人工合成方法为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草为育成抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体剂基因时只能以受精卵为受体基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的的基基因工程经常以抗菌素抗性基因为目的的基因因错误错误正确正确错误错误错误错误用基因工程的方法培育的抗虫植物也能抗病用基因工程的方法培育的抗虫植物也能抗病毒毒基因工程在畜牧业上应用的主要目的是培育基因工程在畜牧业上应用的主要目的是培育体型巨大、品种优良的动物体型巨大、品种优良的动物基因工程在医药方面，可用于基因诊断和治基因工程在医药方面，可用于基因诊断和治疗疾病疗疾病基因工程在环境保护方面可用于环境监测和基因工程在环境保护方面可用于环境监测和对污染环境的净化对污染环境的净化错误错误错误错误正确正确正确正确将将ada（酸脱氨酶基因）通过质粒（酸脱氨酶基因）通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是氨酶。下列叙述错误的是A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点酶识别位点C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个一个adaD.每个人的每个人的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子分子C解析：解析：C错误：基因工程通常不选择天然质错误：基因工程通常不选择天然质粒直接作为目的基因的载体，而选择以天然粒直接作为目的基因的载体，而选择以天然质粒为基础，人工改造和组建形成的实用质质粒为基础，人工改造和组建形成的实用质粒作为目的基因的载体。这种实用质粒不是粒作为目的基因的载体。这种实用质粒不是单纯为某一目的基因构建的，而需要有较广单纯为某一目的基因构建的，而需要有较广泛的使用功能，也就是说要能够和多种目的泛的使用功能，也就是说要能够和多种目的基因形成重组质粒。由于不同的目的基因两基因形成重组质粒。由于不同的目的基因两端的碱基序列存在差异，因此提取不同的目端的碱基序列存在差异，因此提取不同的目的基因选择的限制性核酸内切酶也不同，所的基因选择的限制性核酸内切酶也不同，所以这种实用质粒就需要有多种限制性核酸内以这种实用质粒就需要有多种限制性核酸内切酶的单一切割位点。切酶的单一切割位点。如质粒如质粒pET28b具有具有BamH、Bgl、Hind等等16种限制性核酸内切酶的单一切割种限制性核酸内切酶的单一切割位点，若用位点，若用BamH处理质粒处理质粒pET28b，在其，在其产生的切口中插入产生的切口中插入ada形成重组质粒，该重形成重组质粒，该重组质粒的另外组质粒的另外15个限制性核酸内切酶识别位个限制性核酸内切酶识别位点都没有插入点都没有插入ada。故。故C选项的含义错误。选项的含义错误。解析：认为解析：认为B选项表述的含义是错误的原因选项表述的含义是错误的原因分析：目的基因和质粒能够形成重组质粒的分析：目的基因和质粒能够形成重组质粒的关键是目的基因和质粒被限制性核酸内切酶关键是目的基因和质粒被限制性核酸内切酶切割后具有切割后具有相同的粘性末端相同的粘性末端。形成相同的粘。形成相同的粘性末端可以采用性末端可以采用两种方法两种方法：用相同的限制用相同的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒；性核酸内切酶切割目的基因和质粒；用同用同尾酶切割目的基因和质粒。尾酶切割目的基因和质粒。若选择同尾酶分若选择同尾酶分别切割目的基因和质粒，再由别切割目的基因和质粒，再由DNA连接酶作连接酶作用形成重组质粒。该重组质粒可能无法被同用形成重组质粒。该重组质粒可能无法被同尾酶中的任何一种限制性核酸内切酶识别和尾酶中的任何一种限制性核酸内切酶识别和切割。切割。如限制酶如限制酶Bgl的识别序列为的识别序列为AGATCT（表示切割位点，下同），限制酶表示切割位点，下同），限制酶BamH的的识别序列为识别序列为GGATCC。若用。若用Bgl切割目切割目的基因（见图的基因（见图1），用），用BamH切割质粒（见切割质粒（见图图2），可获得具有相同粘性末端序列），可获得具有相同粘性末端序列（GATC）的）的DNA片段。再用片段。再用DNA连接酶处连接酶处理形成重组质粒（见图理形成重组质粒（见图3），其），其“接点接点”的碱的碱基序列为基序列为5AGATCC3，既不能被，既不能被Bgl识识别，也不能被别，也不能被BamH识别，故认为重组质识别，故认为重组质粒可能不存在限制性核酸内切酶的识别位点。粒可能不存在限制性核酸内切酶的识别位点。实际上基因工程技术的操作过程中会遇到很实际上基因工程技术的操作过程中会遇到很多问题，如重组质粒导入受体细胞后，目的多问题，如重组质粒导入受体细胞后，目的基因的表达可能会出现目的基因不表达、表基因的表达可能会出现目的基因不表达、表达水平过低或过高、表达产物的氨基酸序列达水平过低或过高、表达产物的氨基酸序列差错等多种表达异常情况。当出现目的基因差错等多种表达异常情况。当出现目的基因的表达异常时，需要回收目的基因，并对目的表达异常时，需要回收目的基因，并对目的基因进行加工修饰，最终使目的基因表达的基因进行加工修饰，最终使目的基因表达出人们所预期的效果。因此在构建重组质粒出人们所预期的效果。因此在构建重组质粒时，要求连接形成的时，要求连接形成的“接点接点”序列，必须能序列，必须能被特定的限制性核酸内切酶识别、切割，以被特定的限制性核酸内切酶识别、切割，以便回收插入质粒的目的基因。便回收插入质粒的目的基因。以图以图3所示的重组质粒为例，它还可以被识别序列所示的重组质粒为例，它还可以被识别序列为为GATC的限制性核酸内切酶切割回收。如使用的限制性核酸内切酶切割回收。如使用Mbo或或Sau3A（两者的识别序列都为（两者的识别序列都为GATC）处理该重组质粒时，在两个处理该重组质粒时，在两个“接点接点”位置将重组质位置将重组质粒重新切割开，形成两个片段，即目的基因和质粒粒重新切割开，形成两个片段，即目的基因和质粒（见图（见图4）。）。认为认为D选项表述的含义是错误的原因分析：选项表述的含义是错误的原因分析：重组质粒随机导入大肠杆菌细胞内，可能存重组质粒随机导入大肠杆菌细胞内，可能存在多个重组质粒同时导入同一个大肠杆菌细在多个重组质粒同时导入同一个大肠杆菌细胞内的情况。此时只要其中一个重组质粒上胞内的情况。此时只要其中一个重组质粒上的的ada表达，其它重组质粒上的表达，其它重组质粒上的ada不表达，不表达，该大肠杆菌也能够合成腺苷酸脱氨酶。故认该大肠杆菌也能够合成腺苷酸脱氨酶。故认为插入质粒的为插入质粒的ada不一定都表达了腺苷酸脱不一定都表达了腺苷酸脱氨酶分子。氨酶分子。基因工程技术操作过程，需要对转化条件的基因工程技术操作过程，需要对转化条件的控制，使每个受体细胞只进入一个重组控制，使每个受体细胞只进入一个重组DNA分子。也就是说试题中提到的大肠杆菌细胞分子。也就是说试题中提到的大肠杆菌细胞内只含有一个重组质粒，因此只要该大肠杆内只含有一个重组质粒，因此只要该大肠杆菌有腺苷酸脱氨酶的产生，就说明插入的菌有腺苷酸脱氨酶的产生，就说明插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子。故至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子。故D选选项的含义正确。项的含义正确。课外复习：金版教程课外复习：金版教程P3例例1，P6例例2，P9例例2.单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。（1）从图中可见，该基因突变是由于）从图中可见，该基因突变是由于_引引起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3个酶切点，突变基因上只有个酶切点，突变基因上只有2个酶切点，经限制酶个酶切点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶片段，与探针杂交后可显切割后，凝胶电泳分离酶片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示示出不同的带谱，正常基因显示_条，突变基因显示条，突变基因显示_条。条。（2）DNA或或RNA分子探针要用分子探针要用_等标记。等标记。利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列（酸序列（-ACGTGTT-），写出作为探针的核糖），写出作为探针的核糖核苷酸序列核苷酸序列_。（3）根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会）根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4次妊娠有胎儿次妊娠有胎儿-1中基因型中基因型BB个体是个体是_，Bb的个体是的个体是_，bb的个体是的个体是_。金版教程金版教程P3例例1基因工程中，需使用特定的限制基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶制酶I的识别序列和切点是的识别序列和切点是-GGATCC-，限制酶，限制酶II的识别序列和切点是的识别序列和切点是-GATC-。根据图示判断下。根据图示判断下列操作正确的是列操作正确的是()A目的基因和质粒均用限制酶目的基因和质粒均用限制酶切割切割B目的基因和质粒均用限制酶目的基因和质粒均用限制酶切割切割C质粒用限制酶质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割，目的基因用限制酶切切割割D质粒用限制酶质粒用限制酶切割，目的基因用限制酶切割，目的基因用限制酶切切割割D金版教程金版教程P6例例2图为某种质粒表达载体简图，小图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶的酶切位点，切位点，ampR为青霉素抗性基因，为青霉素抗性基因，tctR为四环素为四环素抗性基因，抗性基因，P为启动因子，为启动因子，T为终止子，为终止子，ori为复制为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。在内的多种酶的酶切位点。（1）将含有目的基因的）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别与质粒表达载体分别用用EcoRI酶切，酶切产物用酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，连接酶进行连接后，其中由两个其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有片段之间连接形成的产物有、三种。若要从这些连接产物中分离出重组质三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行粒，需要对这些连接产物进行。（2）用上述）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是含有的连接产物是；若接种到含青霉素；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是产物是。（3）目的基因表达时，）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的聚合酶识别和结合的位点是位点是，其合成的产物是，其合成的产物是。（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是应选用的酶是。金版教程金版教程P9例例2下表中列出了几种限制酶识别序下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，圈列及其切割位点，圈l、圈、圈2中箭头表示相关限制酶中箭头表示相关限制酶的酶切位点。的酶切位点。（1）一个图）一个图1所示的质粒分子经所示的质粒分子经Sma切割前后，切割前后，分别含有分别含有个游离的磷酸基团。个游离的磷酸基团。（2）若对图中质粒进行改造，插入的）若对图中质粒进行改造，插入的Sma酶切酶切位点越多，质粒的热稳定性越位点越多，质粒的热稳定性越。（3）用图中的质粒和外源）用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不构建重组质粒，不能使用能使用Srna切割，原因是切割，原因是。（4）与只使用）与只使用EcoRI相比较，使用相比较，使用BamH和和Hind两种限制酶同时处理质粒、外源两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优的优点在于可以防止点在于可以防止。（5）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的）为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入基因片段混合，并加入酶。酶。（6）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了）重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了。下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否下列哪一种方法不能用于检测目的基因是否成功导入或表达成功导入或表达A将目的基因直接打上放射性标记，导入将目的基因直接打上放射性标记，导入受体细胞后用检测仪跟踪受体细胞后用检测仪跟踪B在含某种抗生素的培养基中培养导入了在含某种抗生素的培养基中培养导入了重组质粒的大肠杆菌重组质粒的大肠杆菌C利用相应的利用相应的DNA探针与受体细胞探针与受体细胞DNA分分子进行杂交子进行杂交D提取受体细胞蛋白质，利用抗原一抗体提取受体细胞蛋白质，利用抗原一抗体特异性反应进行检测特异性反应进行检测A解析：成功导入（解析：成功导入（转化转化）之后还要能够保持在子代）之后还要能够保持在子代细胞中稳定存在才可以，有些质粒虽然初次可以导细胞中稳定存在才可以，有些质粒虽然初次可以导入，但是可能不能在宿主细胞中稳定存在和大量复入，但是可能不能在宿主细胞中稳定存在和大量复制，宿主细胞多次分裂之后就丢失了。即使可以稳制，宿主细胞多次分裂之后就丢失了。即使可以稳定存在，而多次繁殖以后，子代细胞也无法跟踪检定存在，而多次繁殖以后，子代细胞也无法跟踪检测，因为新合成的子代目的基因的测，因为新合成的子代目的基因的DNA分子不具分子不具有放射性，也就无法跟踪判断了。有放射性，也就无法跟踪判断了。另一种角度：另一种角度：B也不能检测表达。也不能检测表达。B选项也是经不起推敲的，受体细胞如果是真核细选项也是经不起推敲的，受体细胞如果是真核细胞呢？胞呢？基因工程中大题基因工程中大题内含子和外显子内含子和外显子什么是基因治疗什么是基因治疗蛋白质工程的原理蛋白质工程的原理精子和卵子的形成过程有什么区别精子和卵子的形成过程有什么区别核移植过程为什么选用核移植过程为什么选用MII期的卵母细胞期的卵母细胞