实验7血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳.ppt

实验十三 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳目的n学习醋酸纤维薄膜电泳分离血学习醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质的原理和方法清蛋白质的原理和方法n学习蛋白质染色的方法学习蛋白质染色的方法n了解电泳法分离血清蛋白质的了解电泳法分离血清蛋白质的临床意义临床意义 原 理1、电泳（电泳（electrophoresiselectrophoresis）法）法 在外电场的作用下，带电颗粒，在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子例如不处于等电状态的蛋白质分子带电荷的蛋白质，在电场中将向着带电荷的蛋白质，在电场中将向着与其所带电荷电性相反的电极泳动与其所带电荷电性相反的电极泳动这种现象称为电泳。这种现象称为电泳。电泳影响因素：电泳影响因素：蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质在电场中移动的速度取决于蛋白质所带的电荷性质、数量及质点蛋白质所带的电荷性质、数量及质点的大小和形状；此外还受外界因素的的大小和形状；此外还受外界因素的影响如，电场强度、溶液的影响如，电场强度、溶液的PHPH、离子、离子强度及电渗等。强度及电渗等。常见的有：常见的有：醋酸纤维膜电泳、醋酸纤维膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳毛细管电泳醋酸纤维薄膜电泳 n醋酸纤维薄膜作为支持介质醋酸纤维薄膜作为支持介质n醋酸纤维薄膜：醋酸纤维薄膜：将纤维素的将纤维素的羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙羟基乙酰化为醋酸酯，溶于丙酮后制成有均一细密微孔的薄酮后制成有均一细密微孔的薄膜，其厚度为膜，其厚度为0.10.10.15mm0.15mm血浆蛋白：血浆蛋白：(1)(1)清蛋白（清蛋白（AlbAlb）、）、11、22、纤维蛋、纤维蛋白原和白原和-球蛋白球蛋白;(2)(2)血浆中蛋白质的血浆中蛋白质的PIPI小于小于7.07.0，在，在PH8.6 PH8.6 BufferBuffer中解离成负离子，在电场中向正极中解离成负离子，在电场中向正极移动。移动。（3 3）在同一）在同一pHpH下所带电荷量多少有差异，各下所带电荷量多少有差异，各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，因而在同一电场中泳动速度不同因而在同一电场中泳动速度不同 。染色剂：n n一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮一般蛋白质染色常使用氨基黑、考马斯亮蓝、丽春红蓝、丽春红n n糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸糖蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸-Schiff-Schiff试剂试剂n n脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白a1-a1-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白a2-a2-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白 球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白点样处点样处醋酸纤维薄膜法显示醋酸纤维薄膜法显示血清蛋白质从阳极端起依血清蛋白质从阳极端起依血清蛋白质从阳极端起依血清蛋白质从阳极端起依次为白蛋白、次为白蛋白、次为白蛋白、次为白蛋白、a1-a1-a1-a1-球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、a2-a2-a2-a2-球蛋白、球蛋白、球蛋白、球蛋白、-球蛋白球蛋白球蛋白球蛋白和和和和球蛋白五条区带球蛋白五条区带球蛋白五条区带球蛋白五条区带 。定量n与蛋白质结合的染料可溶解于与蛋白质结合的染料可溶解于碱液，溶液颜色深浅与蛋白质碱液，溶液颜色深浅与蛋白质量呈正比量呈正比 n比色法比较各蛋白质条带溶于比色法比较各蛋白质条带溶于碱后的溶液颜色，可计算出各碱后的溶液颜色，可计算出各种蛋白质所占的百分比种蛋白质所占的百分比计算n nODOD总和总和 T T A +1+2+A +1+2+n n白蛋白白蛋白 A/T 100 A/T 100n n11球蛋白球蛋白 1/T 1001/T 100n n22球蛋白球蛋白 2/T 1002/T 100n n球蛋白球蛋白 /T 100/T 100n n球蛋白球蛋白 /T 100/T 100操操 作作1、准备、准备（1 1）电泳仪的准备）电泳仪的准备（2 2）薄膜的准备：）薄膜的准备：n在薄膜无光泽面标记点样位置在薄膜无光泽面标记点样位置 n将薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡将薄膜置于巴比妥缓冲液中浸泡2、点样、点样（1）无光泽面朝上，吸去多余无光泽面朝上，吸去多余Buffer,Buffer,（2 2）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线）用盖玻片蘸取少量血浆，垂直印在划线 处。处。注意注意：不能超出边缘；不能重复点样；必须不能超出边缘；不能重复点样；必须与边缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破与边缘平行要适量、均匀和垂直，并避免弄破薄膜薄膜。杨1.5cm8cm2cm3 3、平衡：、平衡：无光泽面朝下，点样侧位于阴极（无光泽面朝下，点样侧位于阴极（无光泽面朝下，点样侧位于阴极（无光泽面朝下，点样侧位于阴极（5min)5min)5min)5min)4 4、电泳：、电泳：打开电源，打开电源，打开电源，打开电源，U U U U160V160V160V160V或或或或I I I I1.6mA1.6mA1.6mA1.6mA t=45 t=45 t=45 t=4550min50min50min50min；冬季；冬季；冬季；冬季1 1 1 1小时小时小时小时5 5、染色：氨基黑、染色：氨基黑10B10B 染色充分，染色充分，染色充分，染色充分，5 5 5 510min10min10min10min6 6、漂洗：、漂洗：3 3 3 34 4 4 4个漂洗皿，洗去染料至背景无色。个漂洗皿，洗去染料至背景无色。个漂洗皿，洗去染料至背景无色。个漂洗皿，洗去染料至背景无色。临床意义 n n血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含血浆蛋白是血浆中最主要的固体成分，含量为量为606080g/L 80g/L，绝大部分由肝脏合成，绝大部分由肝脏合成，仅仅球蛋白由浆细胞合成球蛋白由浆细胞合成 n n正常值：正常值：白蛋白白蛋白57577272n n 1 1球蛋白球蛋白2 255 n n 2 2球蛋白球蛋白4 499 n n 球蛋白球蛋白6.56.51212 n n 球蛋白球蛋白12122020 血浆蛋白的主要功能 n维持血浆胶体渗透压维持血浆胶体渗透压 n调节血浆调节血浆pHpH值，维持酸碱平衡值，维持酸碱平衡 n运输营养物质、代谢物、激素、药运输营养物质、代谢物、激素、药物及金属离子等物及金属离子等 n免疫作用免疫作用 n n肝炎：白蛋白、肝炎：白蛋白、a1-a1-球蛋白、球蛋白、a2-a2-球蛋白、球蛋白、-球蛋白下降，球蛋白下降，球蛋白升高球蛋白升高n n肝硬化：白蛋白、肝硬化：白蛋白、a1-a1-球蛋白、球蛋白、a2-a2-球蛋白球蛋白下降明显，下降明显，球蛋白极度升高球蛋白极度升高n n肾病综合症：白蛋白降低，肾病综合症：白蛋白降低，22和和球蛋白球蛋白升高升高 临床检测：