实验八酵母核糖核酸的分离及组分鉴定、DNA的Tm值测定.ppt

实验八实验八 酵母核糖核酸的分酵母核糖核酸的分离及核酸组分鉴定离及核酸组分鉴定 一、目的一、目的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。方法。二、原理二、原理酵母核酸中酵母核酸中RNA含量较多。含量较多。RNA可溶于碱可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。的粗制品。核糖核酸含有核糖、嘌呤碱，嘧啶碱和磷核糖核酸含有核糖、嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。解液中可以测出上述组分的存在。三、操作三、操作 1、提取：、提取：将将2 g酵母悬浮于酵母悬浮于10ml 10%NacL溶液中（溶液中（50ml锥形瓶），经膨胀、摇匀后置锥形瓶），经膨胀、摇匀后置100沸水浴上加热沸水浴上加热30min后，冷却。离心后，冷却。离心（3,500r/min）10min,将预冷的将预冷的 酸性乙醇溶酸性乙醇溶液以等体积倾入上清液液以等体积倾入上清液 中。注意要中。注意要 边搅拌边搅拌一边倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心一边倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心（3，000r/min）5min。得到沉淀物用适量得到沉淀物用适量的的0.5mol/L碳酸氢钠溶液溶解后，再用碳酸氢钠溶液溶解后，再用SC溶液定容至溶液定容至10ml。2、DNA和和RNA成分鉴定：成分鉴定：1）、嘌呤碱）、嘌呤碱 取两支小试管，分别加入取两支小试管，分别加入0.5mlDNA和和RNA样品溶样品溶液，然后在每支试管中加入液，然后在每支试管中加入0.5ml 10%氨水和氨水和0.5ml 0.1mol/LAgNO3混匀后，观察沉淀物及其颜混匀后，观察沉淀物及其颜色的变化色的变化2）、核糖）、核糖 取两支试管分别加入取两支试管分别加入DNA和和RNA样品溶液样品溶液0.5ml、二苯胺溶液、二苯胺溶液0.5ml。放沸水浴中放沸水浴中10min。注意溶液是否变成蓝色，。注意溶液是否变成蓝色，说明该方法的专一性。说明该方法的专一性。3）、磷酸：）、磷酸：取两支试管，加入取两支试管，加入DNA 和和RNA样品溶液样品溶液0.5ml和定磷试剂和定磷试剂0.5ml。在。在水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说水浴中加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在，两支试管的颜色的深浅明磷酸是否存在，两支试管的颜色的深浅度为什么有差异。度为什么有差异。四、思考题四、思考题p43页页3、6、7实验九实验九 DNA Tm值的测定值的测定 一、目的一、目的正确理解正确理解DNA 的的Tm值的定义及测定值的定义及测定Tm值值的意义；的意义；掌握掌握DNA Tm值的测定方法；值的测定方法；了解了解DNA变性、复性的机理与条件。变性、复性的机理与条件。二、原理二、原理当当DNADNA在稀盐溶液中加热到在稀盐溶液中加热到80-10080-100时，双螺旋结时，双螺旋结构即发生解体，两链分开，形成无规则线团。与构即发生解体，两链分开，形成无规则线团。与此同时发生了一系列理化性质的变化，此同时发生了一系列理化性质的变化，其中其中260nm260nm的消光值增高（增色效应）；的消光值增高（增色效应）；粘度降低；浮力密粘度降低；浮力密度降低等。度降低等。DNADNA的这些变化是属于爆发式的，变性的这些变化是属于爆发式的，变性作用发生在很窄的温度范围内。作用发生在很窄的温度范围内。通常把通常把DNADNA的双螺的双螺旋结构失去一半时的温度称为该旋结构失去一半时的温度称为该DNADNA的熔点或熔解的熔点或熔解温度（温度（melting temperaturemelting temperature）,用用TmTm表示，表示，DNADNA的的TmTm值一般在值一般在70-8570-85之间。变性后的之间。变性后的DNADNA在温度降在温度降低的过程中得以复性，低的过程中得以复性，A260nmA260nm值再次下降到接近值再次下降到接近自然状态的消光值。自然状态的消光值。DNA的的Tm值的影响因素值的影响因素:DNA的均一性的均一性 均一性越高的样品，熔解均一性越高的样品，熔解的温度范围越窄；的温度范围越窄；G-C含量含量 Tm值是随值是随G-C含量增高而增高含量增高而增高的。由的。由Tm值可推算出值可推算出G-C的含量。其经验公的含量。其经验公式为式为 （G-C）%=（Tm-69.3）2.44；介质中离子强度介质中离子强度 一般离子强度较低的介一般离子强度较低的介质中质中DNA熔解温度较低，熔解温度也较宽。熔解温度较低，熔解温度也较宽。三、操作步骤三、操作步骤 1、将、将8个恒温水浴箱，调节温度为个恒温水浴箱，调节温度为50、60、70、75、80、85、90、95、1002、取取12支有盖的大试管，各管加入支有盖的大试管，各管加入3ml DNA溶液，溶液，盖上帽子，在各水浴箱中分别放一支，在盖上帽子，在各水浴箱中分别放一支，在100水浴水浴锅中放三支，另有一支放在室温下，保温锅中放三支，另有一支放在室温下，保温15min后迅后迅速取出，并保持温度去测定各管（速取出，并保持温度去测定各管（10管）管）DNA溶液溶液的的A260nm。以以10.15mol/LNaCl-0.015mol/L柠檬酸柠檬酸钠缓冲液钠缓冲液pH7.0,为对照液。为对照液。3、将在将在100保温保温15mon后的另两支装有后的另两支装有DNA溶液溶液的试管取出，分别放在的试管取出，分别放在50和室温下和室温下0.5h以上，再在以上，再在260nm波长下测定消光值。波长下测定消光值。四、结果与分析四、结果与分析1、计算各温度下的、计算各温度下的A260nm（t）/A260nm（25），），并以此比值对温度作图（见图十三），连接各点成平并以此比值对温度作图（见图十三），连接各点成平滑曲线，滑曲线，测定出消光值增加的中点测定出消光值增加的中点，此即，此即Tm。计算。计算G-C%含量。含量。公式为：（公式为：（G-C）%=（Tm-69.3）2.442、测出在、测出在100处理后、置处理后、置50和室温下放置和室温下放置0.5h以以上的上的DNA溶液的消光值（溶液的消光值（A260/50和和A260室温），室温），分析该两个数值是否存在差异性及产生差异性的原因。分析该两个数值是否存在差异性及产生差异性的原因。