噬菌体展示技术的原理.ppt
噬菌体展示技术的原理 噬菌体展示的基本概念 将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合,并在其表面展示,同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。直接将可见的表达型与其基因型联系在一 起,利用其配体的特异性亲和力,将所感兴趣的蛋白 质或多肽挑选出来。多年来,噬菌体展示技术被用于 抗 体 的 制 备、多 肽 及 蛋白 质 和 酶 的 制 备。特别是近几年来,该技术被作为一种新工具用于多 肽 和 蛋 白 质 药 物 的 发 现 与 研 制、蛋 白 质 与 蛋 白 质 的相 互 作 用及 蛋 白 质 与D N A 相 互 作 用 的 研 究、蛋 白 质 结 构 和 功能 的 研 究以及 基 因 治 疗 药 物 的 定 向 传 递等 多 方 面 的研究。一、噬菌体展示技术的原理Lead Hv Link Lv PIIIPIII表达型融合蛋白P 菌毛蛋白 35个拷贝P 主要衣壳蛋白 27003000个拷贝基因型 噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。选择方法：淘选（Panning)而不是 筛选（Screening)Solid phase selection with immunotubes BB B BBBvvImmunotubecoated withantigencoated withsteptavidin and biotinylated antigenBbiotin antigenSolution phase selection with biotinylated antigen Bind to Streptavidin coated microtitre wellsWash to remove unbound phage particles.Elute bound phageAmplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea)ELISAb)Specificityc)Sequencingd)Affinitye)ActivityE.coli感染和扩增 固相 淘选系统 完整细胞 组织，器官 常规法 淘选方法 正负法 竞争法 噬菌体展示技术最关键的优势有三：第一，淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；第三：展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。噬菌体（M13,T7,T4,)病毒（反转录病毒，杆状病毒）表面展示系统 细菌（葡萄球菌，E.Coli)酵母 体外共价连接（蛋白DNA,蛋白RNA)诊断 被动免疫 抗体 蛋白质结构分析 药物导航 蛋白质纯化 应用范围：受 体 配体 信息传递 蛋白质蛋白质 诘抗剂 蛋白质DNA 抑制剂 蛋白质其他 多肽 诊断 基因表达控制 中和活力 药物及药物导航 酶及底物噬菌体抗体库的构建Antibody IgG structureAntibody IgG structureVHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab)2FabFcMembraneExtensionAntibody IgG structureVHVLCLCH1CH2CH3Antibody IgG structureVHVLCLCH1CH2CH3FvFvVHVLscFvVHVLSingle Chain Fragment variable噬菌体展示ScFv抗体操作示例PCR产物的酶切（先平连再消化）载体的酶切库的连接反应电穿孔转化感受态E.Coli TG1细胞的制备抗体库的构建筛选检测分泌型ScFv的产生 测序包括数轮识别-洗脱-复制的过程 活性克隆制备 质粒DNA，VH 和VL基因重新 克隆于通用载 体，利用通用 引物测序。PCR直接测序 电穿孔导入 加入AMP抗性 先构建轻链，再构建重链 加入辅助噬菌体 加入卡那霉素 PEG-NaCl收集 a)ELISA检测 b)特异型检测 c)序列测定 d)亲和性测定 e)活性测定 单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术宿主细胞:杂交瘤 细菌 筛选范围:103 107109时间:几个月 几周 操作:繁杂 相对简单 免疫:必须 可避免人源抗体:+费用:高 低生产量:有限 无限基因获取:再克隆 直接 应用前景:有限 不可估 二、噬菌体展示技术的应用现状 1.抗体：2.抗狂犬病毒的单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并表达有gp120的淋巴细胞,中和响尾蛇毒素的单链抗，等等。2.疫苗：3.展示在噬菌体表面的HIV-1 的gp120-V3 环 可象天然抗原一样引起显著的免疫应答,等等。3.多肽类药物：如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒-bungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性；等等。4.肿瘤药物导航载体：5.用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具。一个成功的实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果.5.酶：例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等 6.底物与抑制剂：主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。7.信息传递研究:利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体，如血管促生素、-bungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折叠区域，如SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽,因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。8.DNA结合蛋白：锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。9.蛋白质组学：噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA 文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。
