《生物技术概论》课件讲义.pdf

生物技术概论课程讲义与教案杜志强2010年8月第一章生物技术总论一、生物技术的含义：生物技术是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础学科，采用先进的工程技术手段，按照设计改造生物体或生物原料，为人类生产出所需要产品或达到某种目的。(1)现代生命科学：目前，普遍认为现代生命科学系统的建立开始于1 6世纪。它的基本特征是人们对生命现象的研究牢固地植根于观察和实验的基础上。(2)先进的工程技术手段：是指基因工程、细胞工程、酶工程、蛋白质工程、发酵工程。(3)生物原料：指生物体的某一部分或生物生长过程中产生的能利用的物质，如淀粉、纤维素等有机物，也包括一些无机化学品，甚至某些矿石。(4)目的：包括疾病的预防、诊断与治疗，食品的检验、环境污染的监测和治理等。二、生物技术的种类及其相互关系：1、生物技术种类。(1)传统生物技术：指旧有的制造酱、酒、面包、奶酪、酸奶及其它食品的传统工艺。(2)现代生物技术：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程。2、五大工程间的关系。基因工程是核心，带动其他四大工程的发展，四大工程的发展又促使基因工程发展更迅猛。基因工程和细胞工程看作生物工程的上流处理技术，将发酵工程和酶工程看作生物工程的下流处理技术。基因工程、细胞工程和发酵工程中所需的酶往往是通过酶工程来获得的。3、生物技术涉及学科。现代生物技术以分子生物学、细胞生物学等几乎所有生物科学次级学科为支撑，又结合了化学、化学工程学等生物学领域之外的尖端基础学科，从而形成一门多学科相互渗透的综合性学科。目前生物技术相关的行业可分为：疾病治疗、检测与诊断、大农业、食品、环境、能源、化学品、设备八大类型。4、生物技术的基本特征。(1)高效益，可带来高额利润。(2)高智力，具有创造性和突破性。(3)高投入，前期需要投入大量资金。（4）高竞争，时效性的竞争非常强烈。（5）高风险，高竞争带来高风险。（6）高势能，对国家的政治、经济、文化和社会发展有很大的影响，具有很强的渗透性和扩散性。三、生物技术发展简史：（-）传统生物技术。从史前时代起就一直为人们所开发和利用。在石器时代后期，我国人民就会利用谷物造酒，这是最早的发酵技术。在公元10世纪，我国就有了预防天花的活疫苗。在西方，苏美尔人和巴比伦人在公元前6000年就已开始啤酒发酵。埃及人则在公元前4000年就开始制作面包。1676年，荷兰人Leeuwenhoek（16321723）制成了能放大170300倍的显微镜,并首先观察到了微生物。19世纪60年代，法国科学家L.PasteurCl822-1895）首先证实发酵是由微生物引起的，并首先建立了微生物的纯种培养技术。上世纪20年代，工业生产中开始采用大规模的纯种培养技术发酵化工原料丙酮、丁醇。5 0 年代，在青霉素大规模发酵生产的带动下，发酵工业和酶制剂工业大量涌现。发酵技术和酶技术被广泛应用于医药、食品、化工、制革和农产品加工等部门。本世纪初，遗传学的建立及其应用，产生了遗传育种学，被誉为“第一次绿色革命”。细胞学的理论被应用于生产而产生了细胞工程。在今天看来，上述诸方面的发展，还只能被观为传统的生物技术，因为它们还不具备高技术的诸要素。（-）现代生物技术。现代生物技术是以70年代DNA重组技术的建立为标志的。1944年 Avery阐明了 DNA是遗传信息的携带者。1953年 Waltson和 Crick提出了 DNA的双螺旋结构模型,阐明了 DNA的半保留复制模式，从而开辟了分子生物学研窕的新纪元。1961年 Khorana、Nirenberg破译了遗传密码，揭开了 DNA编码的遗传信息是如何传递给蛋白质这一秘密。1972年 Beng首先实现了 DNA体外重组技术，标志着生物技术的核心技术基因工程技术的开始。它向人们提供了一种全新的技术手段，使人们可以按照意愿在试管内切割DNA、分离基因并经重组后导人其他生物或细胞，藉以改造农作物或畜牧品种；也可以导人细菌这种简单的生物体，由细菌生产大量的有用的蛋白质，或作为药物，或作为疫苗；也可以直接导人人体内进行基因治疗。显然，这是一项技术上的革命。以基因工程为核心，带动了现代发酵工程、现代酶工程、现代细胞工程的发展，形成了具有划时代意义和战略价值的现代生物技术。下图是针对苏格兰羊的转基因技术：细的体入卵腺中倍植核乳胸双核去中四、生物技术对社会经济的影响：(-)改善农业生产、解决食品短缺。1、提高农作物产量及其品质。(1)培育抗逆的作物优良品系：第一株转基因植物：1982年美国和比利时的学者，分别把细菌中抗碘那霉素基因转入向日葵，烟草和胡萝卜的细胞中，使这些植物的抗药性提高八倍多。(2)植物种苗的工厂化生产。我国已建立了多种植物试管苗的生产线，如葡萄、苹果、香蕉、柑橘、花卉等。(3)提高粮食品质。美国威斯康星大学的学者将菜豆储藏蛋白基因转移到向日葵中，使向日葵种子含有菜豆储藏蛋白。(4)生物固氮，减少化肥使用量。(5)生物农药，生产绿色食品。2、发展畜牧业生产。(1)动物的大量快速无性繁殖。1 9 9 7 年 2月英国R o s l i n 研究所用绵羊乳腺细胞培育出一只小羊一一多莉。这意味着动物体细胞同样有可能进行动物的大量、快速无性繁殖。（2）培育动物的优良品系。第一例转基因动物：19 8 0年美国华盛顿大学和宾西法尼亚大学的学者，把大老鼠的生长激素基因与小老鼠的一段基因拼接在一起组成一个重组体，把这个重组体注射到小老鼠的受精卵里，再把受精卵移植到借腹怀胎的雌鼠体内，生下的小鼠其生长速度比普通小鼠的平均生长速度快5 0%o此外，还有采用基因打靶技术培育转基因克隆羊、利用乳腺生产药用蛋白的转基因羊、用于人体器官移植的转基因猪。（二）提高生命质量，延长人类寿命。1、开发制造奇特而又贵重的新型药品。19 7 7 年 11月，美国人工方法化学合成了人生长激素释放抑制素基因。美国首先采用大肠杆菌生产了人类第一个基因工程药物一一人生长激素释放抑制激素。此外，还开发了人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等。2、疾病的预防和诊断。（1）19 9 8 年初，美国食品和药物管理局（F D A）批准了首个艾滋病疫苗进入人体试验。（2）DNA探针，主要用来诊断遗传性疾病和传染性疾病。（3）19 7 5 年，英国科学家米尔斯坦利用细胞融合技术将一个B型淋巴细胞，和一个骨髓瘤细胞融合在一起形成一个杂交瘤细胞，其产生的抗体叫做单克隆抗体。3、基因治疗。（1）19 9 0年 9月，美 国 F A D 批准了用A D A（腺首脱氨酶）基因治疗严重联合型免疫缺陷病（一种单基因遗传病），并取得了较满意的结果。（2）从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物t P A。后代中有的羊携带人“A基因4、人类基因组计划（HGP）。1986年美国生物学家诺贝尔奖获得者Dulbecc。首先倡议，全世界的科学家联合起来从整体上研究人类的基因组，分析人类基因组的全部序列以获得人类基因所携带的全部遗传信息。毫无疑问，该项工作的完成，将使人们深入认识许多困扰人类的重大疾病的发病机理；9 0年代的人类基因组计划的科学意义如同60年代的登月计戈I。所以继美国之后，欧盟国家、日本、俄罗斯、加拿大、澳大利亚和我国也相继启动了人类基因组计划。1990年开始启动，计 划15年内完成人类全部基因组3 0亿个碱基对的排列顺序的测定和图谱分析。即把人体内十万个基因所在的位置确定下来，把基因分离出来，研究其功能，认识基因和疾病的关系。一般把找到的基因称为靶基因。基因治疗就是对相关的基因进行抑制或调整。所有的药物开发，是先在靶基因上实验的。因此有了基因，就可以制造基因工程诊断试剂，基因工程治疗药物，甚至形成治疗这种疾病的药物产业。（三）解决能源危机、治理环境污染。（四）制造工业原料生产贵重金属。利用微生物在生长过程中积累的代谢产物，生产食品工业原料，种类繁多。概括起来，主要有以下几个大类：氨基酸类：主要的有谷氨酸（即味精）、赖氨酸等；酸味剂：主要有柠檬酸、苹果酸等.甜味剂：主要有天冬甜精（甜味是砂糖的2400倍）、氯化砂糖（甜味是砂糖的600倍）。发酵技术还可用来生产化学工业原料。主要有传统的通用型化工原料如乙醇、丙酮、丁醇等产品。在冶金工业方面，高品位富矿不断耗尽。面对数量庞大的废渣矿、贫矿、尾矿、废矿，采用一般的采矿技术已无能为力，惟有利用细菌的浸矿技术才能对这类矿石进行提炼。可提取的金属包括金、银、铜、铀、镒、钥、锌、钻、银、钢、铭等10多种贵重金属和稀有金属。（五）生物技术的安全性及其对伦理、道德、法律的影响。第二章基因工程第一节基因工程概论一、基因工程的含义：应用人工方法把生物的遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行切割、拼接和重组。然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息在新的宿主或个体中大量表达，以获得基因产物。这种通过体外DNA重组创造新生物并给予特殊功能的技术。基因工程的基本特点是，分子水平操作，细胞水平表达。具体如下所示：（基因工程的别名：基因拼接技术或DNA重组技术操作环境：生物体外操作对象：基因操作水平：DNA分子水平基本过程：剪切一拼接-导入一表达I结果：人类需要的基因产物二、基因工程研究的理论依据1、不同基因具有相同的物质基础。地球上的几乎所有生物的基因都是一个具有遗传信息的特定核甘酸序列的DNA片段，而所有生物的DNA的组成基本结构都是一样的，从而使得不同生物间进行基因重组互换是可能的。2、基因是可以切割的。可以采用特定的限制性核酸内切酶对基因进行人为切割。（1）限制性核酸内切酶E eRI的酶切位点：来源：主要从原核细胞分离。作用：一种限制性内切酶只能识别双链DNA分子的某种特定的核昔酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核甘酸之间的磷酸二酯键断开（切割DNA分子）。结果：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核甘酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。(2)其他几种限制性核酸内切酶的酶切位点:nNQn口AHu目口口日口w.nwHurt口用MmHu0m口口臼口目口u讨U.MHUM日口WUMmSomH 1m口口日wu0m日二1 G IQ口白OJ3.HHHuMm口口UN日口50自口口ffQ.回TE3、基因是可以转移的。基因可以在同一染色体上转移(转座子)，可以在不同染色体间转移(重组)，也可在人为条件下在不同物种之间转移(转基因)。4、多肽与基因之间存在对应关系。一酶一基因理论(one gene/one enzyme hypothesis)的不足之处：(1)有些的不是由一条肽链组成；(2)有些基因编码的肽链不是酶；(3)有些基因的产物是R N A,不是Pro。5、遗传密码是通用的。这决定了某一基因导入任何种类的生物中，由其所编码的Pro中的氨基酸序列相同。如:将人的胰岛素基因等导入细菌中，由细菌生产出人的胰岛素。将一些外源基因导入植物细胞,培育出诸如抗虫棉花等植物新品种。将人的有关基因转移到动物细胞，得到诸如含有人干扰素的羊奶等。6、基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代。三、基因工程操作的基本技术路线1、技术路线：克隆载体-1-目的基因v重组DNA-1-受体细胞克隆子I转基因生物2、基因工程操作的基本步骤：（1）提取目的基因：目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽抱杆菌的抗虫基因，还有植物的抗 病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。从供体细胞的D N A 中直接分离基因（如“鸟枪法”）、人工合成基因（反转录法、化学合成法）。常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。三种目的基因提取方法的优缺点:鸟枪法优 点缺 点操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因。反转录法专一性强操作过程麻烦，m R N A很不稳定，要求的技术条件较高。化学合成法专一性最强仅限于合成核甘酸对较少的简单基因（2）目的基因与载体结合:（3）将重组子导入受体细胞：目的基因导入受体细胞的方法如下:1、将细菌用C a C 1 2处理，以增大细菌细胞壁的通透性。，2、使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。3、目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。（4）目的基因的检测和表达：检测：通过检测标记基因的有无来判断目的基因是否导入。表达：通过特定性状的产生与否来确定目的基因是否表达。3、图示基因工程操作的基本步骤:取 出DNA用 限 制 酶 切 断DNA细菌用连接的连接细胞取出质粒受便田胞目 诞重组的质粒四、基因工程研究最突出的优点打破了常规育种难以突破的物种之间的界线，可以使基因在不同生物之间进行转移和表达。第二节目的基因的获得一、目的基因的含义、来源1、目的基因：在基因工程设计和操作中，被用于基因重组、改变受体细胞性状和获得预期表达产物的基因称为目的基因。2、目的基因的来源：真核生物染色体基因组：蕴臧着大量的基因，是目的基因的主要来源。原核生物染色体基因组、J质粒基因组/所含基因数目较少，是目的基因的次要来源病 毒（噬菌体）基因组线粒体、叶绿体基因组二、分离目的基因的途径在分离目的基因时，可根据目的基因所在基因染色体基因组的大小、目的基因的大小、序列是否已知等因素，采用不同的方法分离目的基因。目前，主要采用以下四种方法分离目的基因：(1)酶切直接分离法；(2)PCR扩增法；(3)化学合成法；(4)构建基因组文库或cDNA文库分离法。1、利用限制性内切核酸酶酶切法分离目的基因：(1)内切脱氧核糖核酸酶的定义：是一类能识别双链DNA中特殊核甘酸序列，并在合适的反应条件下使每条链一定位点上的磷酸二酯键断开，产生具有5-磷 酸 基(-P)和 3-羟 基(-0 H)的 DNA片段的内切脱氧核糖核酸酶。(2)限制性核酸内切酶的分类：至今发现的限制性核酸内切酶有三类：1、II、IH型的内切酶。真正有用的是H型内切的。(3)限制性核酸内切酶的识别位点：限制性核酸内切酶在D N A上能够识别的核甘酸序列称为识别序列或者识别位点。一般识别序列为4-6bp,大部分为二分体对称切割(双重交替式)呈旋转对称或左右互补对称。即一条链的5-3,与另一条链的3、5,的碱基相同。例如：E c o R i的酶切位点是GAATTC(G 与 A 之间切开)Xho I的酶切位点是CTCGAG(C与 T 之间切开)黏性末端：两条多核昔酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是交错的，产生的DNA片段末端的一条链多出一至几个核甘酸,这样的末端称为黏性末端。3,端比5,短长的称为3,黏性末端;反之，称为5,黏性末端。平末端：如果两条多核苜酸链上磷酸二酯键断开后产生的DNA末端是平齐的，称为平末端。(4)限制性核酸内切酶的反应体系：C DNA片段：10微升水：6 微升缓冲液：2 微升酶1：1微升 酶2：1微升(5)限制性核酸内切酶的使用方法:A.双酣切：常用方法B.单酶切：很少使用(6)图示酶切结果：A.产生黏性末端:NICSy夕GcATc-G割TAl切T-AAA-TATccIGAITyy5A+A出A突5TyTGcCIGA-1TyTB.产生平齐末端:5，A A G A T A T C G Tri i n i i H i iJ.!T C T A T A G C A5,切割5,A A G A T 3，T3GCT5,A3，T TT A平整末端2、利用PCR的技术扩增目的基因:PCR(polymerase chain reaction)技术即聚合酶链式反应技术，可以简单、快速、特异性得在体外扩增某一 DNA片段。(1)PCR的发明：1985年 Cetus公司的科学家K.B.Mullis发明了 PCR,Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。T h e N o b e l P r i ze i n C h e m i s t r y1 993“for contributions to the developments of methods within DNA-basedchemistry*Press releasefor his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method*Kary B.MullisUSALa Jolla,CA,USA1944-Autobiography“for his fundamental contributions to the establishment ofoligonucleiotide-based,site-directed mutagenesis and itsdevelopment for protein studies*Michael SmithCanadaUniversity of British ColumbiaVancouver,Canada1932-Autobiography(2)PCR的基本原理：PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，以 DNA互补链聚合反应为基础,通过靶DNA变性，引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列复性杂交，耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。（3）PCR的具体过程:第一步：预变性。90-95（3-5分钟），双链DNA变性成两条单链，作为PCR反应的模板。第二步：变性。90-95（30秒），双链DNA变性成两条单链，作为PCR反应的模板。第三步：退火。37-60（45秒），引物优先与模板复性（引物的浓度高，引物的链短）。第四步：延伸。70-75C下 1-2分钟，耐热性DNA聚合酶在引物的3,端上加上核甘酸。第五步：变性一复性一延伸重复20-35个循环。第六步：后延伸。70-75下 10分钟。第七步：反应终止。（4）PCR反应体系：模板DNA：含目的基因的DNA片段。耐热性的DNA聚合酶：催化反应的进行，高温下仍保持活性，主要有TaqDNA聚合酶。PCR引物：与待扩增片段的两个末端互补，长度一般为20-22bp。dNTP：四种脱氧核糖核甘酸单体（dATP、dTTP、dCTP、dGTP、）。水：灭菌水。反应缓冲液：维持反应的pH值.PCR反应的扩增效率：在 PC R 反应过程中，由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板D N A,所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加1倍。因此，PCR经过n 次循环后，待扩增的DNA片段理论上可达到原拷贝数的2n倍。但是，由于每次循环的效率并非100%,实际产量低于理论数值。（6）PCR的发展：PC R 技术自问世以来，得到了极其广泛的应用与发展。目前，根据不同的目的已建立了多种PCR技术，如：反向PCR、不对称PCR、锚定PCR、定量PCR等。（7）图示PCR技术的反应过程：L3、化学合成目的基因：目前，利 用 D N A 合成仪，可根据待合成的D N A 片段预定的核甘酸顺序，自动地将4种核甘酸单体（A、T、C、G）按 3,方向连接成寡核甘酸片段。此种方法一般用于合成较短的寡核甘酸片段（如：引物、寡核甘酸连杆、衔接头、较短的目的基因等），很少用于合成较长的目的基因。如果要合成较长的目的基因，需先按照基因的核甘酸顺序化学合成几个200bp左右的DNA片段，然后采用酶促连接法等再组装成完整的目的基因（即使这种方法能行得通，但实践中很少采用）。4、通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因：（1）基因组文库及cDNA文库的概念基因组文库:某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌克隆子群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。若这个群体中只贮存某种生物基因组的部分遗传信息，称部分基因组文库。cDNA（complementary DNA）：以 mRNA 为模板逆转录出的 DNA 称为 cDNA。cDNA文库：某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌克隆子群体中，这样的群体称cDNA文库。（2）构建基因组文库的基本步骤组织或细胞 载体（选择一种）Im R N AcD N A大小分级I”可供克隆的DNA片段-连接片段和载体将连接载体/靶DNA引入大肠杆菌（体外包装或转化）鉴定文库筛选目的克隆扩增文库长期保存（3）图示c D N A 的克隆过程:RE-Synthesis and dewing of cDNA(4)从基因组文库或c-DNA文库中获得目的基因A.根据目的基因已知核昔酸序列进行筛选分离：原理：根据目的基因已知的核甘酸序列制备核酸探针，对基因组或cD N A 文库的一系列克隆子的DN A分子进行杂交，能杂交的克隆子就含有目的基因。进一步对阳性克隆子的重组DN A进行测序，与已知基因的核甘酸序列进行比较和鉴定，确定是否是待分离的目的基因。B.根据目的基因特异性表达进行分离：原理：不同组织器官中表达的基因类型不同。以不同组织器官中的总mRNA为探针，分别对两利icD N A 文库进行杂交比较，确定其中的阳性克隆子。如下图所示：第三节基因克隆载体一、基因克隆载体(gene clone vector)的概念：能够承载外源基因，并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子称为基因克隆载体。二、基因克隆载体应具备的条件：1、在合适的位置必须含有允许外源DNA片段组入的克隆位点。T7 promoter演(3206)pETBlue-2(3653bp)MCS麴 加(276)疑 磁 685)丽 C290)E ai36H 695)GOT)W I (301)I GOT)薮 照I 013)I 6 20)n 020)m i G3o)SseB387I G30)Sal I (335)则.H C336)加 H C337)(1096-1551)fl origin/E.Coli.TiICl厚Im惠i玲v45)(348)(353)659)Hijad I I I(962)lag I 0369)lo t I (369)H G79)Bstuorn(384)9 I (389)W I (431)Pac I (464)2、能携带外源DNA片段进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA、线粒体DNA和叶绿体DNA中，随这些DNA的复制而同步复制。3、必须含有供选择转化的标记基因。4、克隆载体必须安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞。以PBR322质粒载体为例，说明以上三个特点：由 谱 PBR322母可坏水的培养基质粒导入成功的菌落无质粒细苗不能生长单个着落分离培养I、只在四环米上生长而氨比西林上不能生长的菌落是带有目的基因的菌落2、在两种培养基上都能生长的菌落是不带有目的居因的芮落西球茶 氧正西林培尿基培养基三、基因克隆载体发展阶段：第一个阶段：质粒载体、入噬菌体载体、柯斯质粒载体为主。特点在宿主细胞内稳定遗传、易分离、转化效率高，单克隆容量有限，一般小于4 5 k b。第二个阶段：主要是酵母人工染色体、细菌人工染色体、源于噬菌体P 1 的人工染色体、人类/哺乳动物人工染色体。特点：载体的容载能力扩大，达l O O k b 至几个M b。第三个阶段：双元细菌人工染色体和可转化人工染色体。特点：载体的容载能力大，具备转化植物的功能。四、几种不同类型的载体以及载体的特点:1、大肠杆菌质粒载体A.大肠杆菌质粒载体是一类应用广泛的克隆载体，能够在转化的大肠杆菌中按质粒复制的形式进行复制。如:pBR322、pUC18/19,EcoRI Ci dl l l I IBomH IRru、AmpicillinresistancegeneTetracyclineresistancegene一XmapBR322Is n 0 1p vul特性：a.pBR322大小为4.363kb为松弛型质粒，复制起始点来源于pMB 1。b.四环素抗性基因(Tetr)M T-pSC IO l,氨节青霉素抗性基因(A m p r)来源于pSF2124。c.8种限制性内切酶的单一识别位点。分别位于Tet抗性基因和Amp抗性基因中。优点：a.分子量小4363bp,统一规定记数从EcoR I识别位点GAATTC的第一个T为1。b.两种抗生素抗性基因，可作为重组体的选择标记，便于筛选重组体。Tetr基因内有5个酶切位点，Ampr基因内有3个酶切位点，O ri内有2个酶切位点。c.具有较高的拷贝数1000-3000/细胞。d.插入失活：因插入外源D N A 片段而使基因失活的现象。B.大肠杆菌质粒载体pUC18/19的序列结构如下所示：pUC系列质粒载体具有三个显著特点：(1)分子量更小，仅为2.7K B,容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数(不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝)。(2)含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZa,可利用a-互补原理进行蓝白筛选。(3)多克隆位点区(MCS)：由人工合成的多个单一酶切位点构成。每一种限制性内切酶会产生不同的粘性末端，可选用两种内切酶组合在质粒载体和外源DNA上产生相同的末端,进行双粘端连接，既提高克隆的效率，又可以定向克隆。其MCS区与Ml3mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到Ml3mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。32、农杆菌Ti质粒载体(1)根癌农杆菌：根癌农杆菌可在许多双子叶植物中导致冠瘦病的形成。冠瘦瘤的形成是由于Ti（tumor inducing）质粒导致的。侵染后，一部分分子将整合到植物的染色体DNA中，这一片段称为T-DNA,大约有15kb-30 kb（编码产物可使植物产生冠瘦瘤）。T-DNA只要保留两端的边界序列，即使中间的序列被任何外源的基因所替代，仍可整合到植物基因组中。（2）作用：利用Ti质粒将新的基因引入植物。可以将基因插入T-DNA中，细菌就可以将它整合到植物的染色体DNA中。（3）图示利用Ti质粒载体将外源基因引入植物细胞中的过程：A n)bncteriiini hiiiier/ncietmDNA containing Ihcgiw of inter凶rislnlioncnzmccutsInM rted T DNAearn ing new genePlant withww traits3、酵母2Hm质粒载体几乎所有的酿酒酵母菌中都存在一种质粒，即2Hm质粒。人们利用2叩1质粒构建了一系列克隆载体。他们一般为穿梭质粒载体，既含有2m质粒的复制起始位点（可在真核细胞中复制），又含有大肠杆菌源质粒的复制起始位点（可在原核细胞中复制）。4、人噬菌体克隆载体（1）人噬菌体的组成：一种温和的诱导性噬菌体，其基因组除在5,端有12个可互补的碱基外均为线性双链DNA,感染时DNA形成环状。是一种感染大肠杆菌的病毒。1951年J.Lederberg的妻子EstherLederberg证明了J.Lederberg和Tatum用来杂交的K12中有原噬菌体，并命名为入，经10年的研究搞清了溶原化的实质。入 噬菌体的基因组长达50K b,共61个基因，其中38个较为重要。(2)人噬菌体构建克隆教体的依据:构建X噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。按照这一基本原理构建的X噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：一种是插入型载体(insertion vectors),只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。另一种是替换型载体(replacement vectors),具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的人DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。在基因克隆中的二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量(一般在10kb以内)的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。(3)构建入噬菌体克隆载体的策略：A.插入型载体外源的DNA克隆到插入型的X载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。插入型的九载体又可以分为免疫功能失活的(inactivation ofimmunityfunction)和大肠杆菌|3-半乳糖昔酶失活的(inactivation of E.coli p-galactosidase)两种亚型。免疫功能失活的插入型载体：在这类插入型载体的基因组中有一段免疫区，其中带有一两种核酸内切限制酶的单切割位点。当外源DNA片段插入到这种位点上时，就会使载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。因此，凡带有外源DNA插入的X重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成混浊的噬菌斑。供半乳糖甘酶失活的插入型载体：它们的基因组中含有一个大肠杆菌的 Iac5区段，其中编码着小半乳糖着酶基因lacZ o由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌,涂布在补加有IPTG和 X-gal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到 lac5区段上，阻断了。-半乳糖着酶基因lacZ的编码序列，不能合成p-半乳糖昔酶，只能形成无色的噬菌斑。B.替换型载体替换型载体又叫做取代型载体(substitution vector),是一类在入噬菌体基础上改建的、在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。入 NM781便是其中的一个代表。在这个替换型载体中，可取代的EcoRI片段，编码有一个supE基因(大肠杆菌突变体tRNA基 因)，由于这种入NM781噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变更被抑制了，能在乳糖麦康基氏(MacConkey)琼脂培养基上产生出红色的噬菌斑，或是在Xgal琼脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。如果这个具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重组体噬菌体，在上述这两种指示培养基上都只能产生出无色的噬菌斑。用替换型载体克隆外源DNA包括三个步骤：第一，应用适当的核酸内切限制酶消化入载体，除去基因组中可取代的DNA区段。第二，将上述所得的人DNA臂同外源DNA片段连接。第三，对重组体的a DN A 分子进行包装和增殖，以得到有感染性的入重组噬菌体。(4)X重组体DNA分子的体外包装：A.X重组体DNA分子的转染作用。用入重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。这种由寄主细胞捕获裸露的噬菌体DNA的过程叫做转染(transfection),它有别于以噬菌体颗粒为媒介的转导(kransduction),入 DNA的转染作用，是一种低效的过程。即便是使用未经任何基因操作处理的新鲜制备的入D N A,其典型的转染效率(即每微克ADNA转染产生的噬菌斑数目)，也仅为105106之间。体外连接的结果，转染效率便下降到104103左右。B.XDNA的体外包装。入 DNA的体外包装作用，在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒中的过程，以形成有功能的病毒载体。根据体外互补作用研究发现，九噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体则只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。C.X噬菌体DNA的包装限制问题。入噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型 DNA总量的5%左右，而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75%。按野生型入DNA分子长度为48kb计算，入噬菌体的包装上限是51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb,因此X载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kbo5、植物病毒克隆载体(1)植物病毒克隆载体种类：用于构建植物病毒克隆载体的病毒种类很多，如：花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(T M V)等。(2)构建植物病毒克隆载体的克隆策略：制备克隆载体时要经过改造，消除其对植物的致病性，保持其转染或转导植物细胞的能力。6、动物病毒克隆载体（1）动物病毒克隆载体的利用：用于构建动物病毒克隆载体的病毒如：痘苗病毒、腺病毒、猿猴空泡病毒、反转录病毒等。（2）典型的动物病毒克隆载体：痘苗病毒克隆载体。痘苗病毒是两端具有倒置重复序列的线型双链DNA分子，编码200多种蛋白。构建痘苗病毒克隆载体一般采用同源重组的方法：将外源基因两端连接上痘苗病毒DNA上具有的基因，如TK（胸背激酶）基因及HA（血凝素）基因，通过同源重组，将外源目的基因整合到痘苗病毒基因组上。痘苗病毒近年来被广泛的用于表达各种外源基因（如：用于表达人血小板生成素）、用于基因治疗及制备基因工程疫苗（如：狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、乙肝疫苗）。7、人工染色体载体（1）人工染色体载体的定义：人工染色体（artificial chromosome）指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。包括酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、P1派生人工染色体（PAC）、哺乳动物人工染色体（MAC）和人类游离人工染色体（HAEC）。人工染色体为基因组图谱制作、基因分离以及基因组序列分析提供了有用的工具。利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体（artificial chromosome vectors）,其装载外源DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美。（2）特点：能容纳长达1000Kb-3000Kb的外源DNA片断，主要用于构建基因组文库，也可用于基因治疗和基因功能的鉴定。如：酵母人工染色体（YAC）载体主要用于构建真核生物基因组DNA文库，因为真核生物许多基因过于庞大而不能作为单一片断克隆于以上提到的载体之中，例如，人凝血因子V III基因长180kb,肌营养不良基因至少长1800kb。（3）人工染色体载体按结构分为线性和环形：线形人工染色体载体：必须含有端粒、着丝点、复制起始区。如：酵母人工染色体（YAC）、人类人工染色体（HAC）、哺乳动物人工染色体（MAC）。环形人工染色体载体：不需端粒及着丝粒，但要有复制起始区。如：细菌人工染色体(BAC),第四节DNA重组一、重组DNA技术的定义重组DNA技术又称为基因克隆或分子克隆技术，包括了一系列的分子生物学操作步骤。重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业。它是基因工程的核心技术，所谓基因工程（genetic engineering）就是把外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制，转录，翻译表达的操作叫基因工程。基因工程可使另一种生物获得新的遗传性状或表达所需要的产物。二、重组DNA操作的一般步骤（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传：（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。如下图：目 的 基 因 表 达产 物（蛋白质转基因动物 转基因植物三、DNA重组的具体过程1、目的基因的获得：前面已经详细介绍。2、载体的制备：前面已经详细介绍。3、目的基因与载体的连接：（l）DNA连接酶：能催化双链DNA片段紧靠在一起的3，-0H末端与5，-P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶。例如，T4DNA连接的既可催化具互补黏性末端DNA片断之间的连接，也可催化具平末端DNA片断之间的连接（效率比较低）。（2）DNA片段之间的连接：A.互补黏性末端片段之间的连接相同的酶产生的黏性末端:连接后仍保持原识别序列。B.平末端片段之间的连接：需T4DNA连接醐进行连接。C.平末端片段末端修饰后连接：不同的限制性核酸内切酶酶切后，产生的末端如果不是互补黏性末端。外切核酸酶VII修饰成平末端然后再进行连接。Y一末端脱氧核音酸转移的（简称末端转移酶）将末端修饰成互补黏性末端再进行连接。图示四种核酸内切酶的酶切序列以及作用位点：H in d IIIC U TC U TAt I（3）