备课素材：mRNA的发现 高一下学期生物人教版必修2.docx

mRNA的发现1961年夏天，有那么几周简直是科学的狂欢宣布发现信使RNA（mRNA）、破解其中的基因编码。虽然mRNA对理解基因作用有绝对重要性，诺贝尔奖却没有发给对它的发现。大量科学家都参与其中，获得的结果具错综复杂，半个世纪走过的研究道路可谓坎坷曲折。这些都反映出，简单确认“谁最先发现mRNA”并不能体现科研的本质。1961年5月13日，自然（Nature）期刊上发表了两篇文章。文章作者共有九人（Sydney Brenner、François Jacob，还有Jim Watson等），他们宣布分离出信使RNA（mRNA）12。同月，François Jacob和Jacques Monod在分子生物学杂志（Journal of Molecular Biology）上发表了一篇综述，他们讨论mRNA理论，论证其在基因调控中的作用。这些文章，不仅体现强大的技术实力，还展现出科学家丰富的想象力，它们体现了人类对基因功能的全新思考。对生命提出新见解，洞察力和深思熟虑固然发挥了决定性作用，但也离不开美国和欧洲众多团队十多年来的研究。他们试图解密：如何从DNA中获取遗传信息来产生蛋白质。我们重构那些年发生的事情，通过研究传出的论文，通过研究那些参与其中的人的回忆，以及2014年8月举行的关于mRNA历史的会议演讲。1944年， Avery、McLeod和McCarty发表论文，这是首次确认肺炎球菌中起“转化原理”（transforming principle）是DNA1011 。从那以后，人们开始接受：DNA的遗传作用。20世纪50年代的大部分时间，”DNA是所有生物体中的遗传物质“是科学家所接受的“工作假说”（working hypothesis），但仅此而已。直到1961年，自然期刊的一篇论文表示，基因或许是由蛋白质而非DNA组成。在此期间，科学家们仍不清楚基因是如何发挥作用，他们持续关注这个问题。1953年，Watson和Crick提出DNA分子上的碱基序列包含“遗传信息”，这是一个重大洞见。科学家的问题于是变成：这些信息如何转化为生物学功能遗传密码的本质是什么，它的工作原理是什么。最初让大家聚焦到这个问题上的是宇宙学家George Gamow。1953 年夏天，Gamow写信给Watson和Crick，提出了一个遗传密码发挥作用的模型，该模型中蛋白质合成发生在DNA分子上。Crick认为Gamow理论模型虽然精巧，但不对。因为Crick相信，蛋白质合成并不直接涉及染色体DNA，而是发生在细胞质中并需要RNA，尽管他完全不清楚这个过程是如何发生的，也不清楚RNA的形式或功能是什么。Crick之所以这么认为，是因为他了解比利时Jean Brachet和瑞典Torbjörn Caspersson的工作。他们在20世纪40 年代报告：RNA主要在细胞质中，蛋白质合成在细胞质里进行，在细胞在合成蛋白质时RNA水平增加。第一个RNA具有基因功能的假说，来自巴黎的André Boivin。他富有远见，最早支持Avery关于DNA是遗传物质的观点。1947年，Boivin与Roger Vendrely在Experientia上发表了一篇法语文章，概述了他的观点；编辑做了一个英文摘要，简洁地表达：“大分子脱氧核糖核酸控制着大分子核糖核酸的构建，而核糖核酸控制细胞质酶的产生”。1952年，罗切斯特医学院的Alexander Dounce提出了一个生化模型，说明蛋白质合成如何发生在RNA分子上，而不在DNA上18。尽管这个模型是错的，但Dounce假设“给定肽链中氨基酸残基的特定排列，源自相应特定核酸分子中核苷酸残基的特定排列”这是首次有人描述了Crick后来的核酸和蛋白质的“共线性”（colinearity）假说。次年，Dounce改进了他和Boivin关于核酸和蛋白质之间联系的概念，将其描述为“脱氧核糖核酸 - 核糖核酸 - 蛋白质”。虽然看起来和我们如今的理解相似，但Dounce并未在描述中具体说明RNA 的形式、位置或功能。当时还没人知道这些。此外，Dounce的模型不是基于不同种类分子之间的遗传信息转移Watson和Crick还没发明出这个想法而是基于三维RNA模板。Dounce认为，每个氨基酸都与DNA和RNA碱基有物理关系，是严格对应的。我们今天理解，它们之间是抽象的信息链接。到了20世纪50年代中期，由于缺乏知识，人们对蛋白质合成过程中细胞质中发生的事情还是糊里糊涂。尽管50年代人们发现，在细胞质中的微粒体（microsomal particles）的结构富含RNA，但直到1958年一次会议的非正式讨论上，它们才被称为“核糖体”（ribosomes）。 核糖体的RNA是唯一被明确识别的RNA形式。许多科学家认为DNA和蛋白质之间所存在的RNA中介，或许就是它。 最重要的是，没有充分证据表明，存在不与蛋白质结合的RNA。1957 年，作为实验生物学协会 (Society of Experimental Biology) 研讨会的一部分，Francis Crick在伦敦大学学院发表了一次演讲。他的演讲题为“大分子的生物复制”。 该讲座因Crick对中心法则（the central dogma）的描述而闻名，于次年出版。中心法则概述了一个细胞内信息转移的假说，并认为信息不可能从蛋白质转移到DNA。 在1956年未流通的一份文件中，Crick画图总结了他的观点（图 1）。图1 Crick在一份未流通的文件中所画的中心法则看起来Crick似乎在说存在mRNA。其实不然。和其他人一样，他仍然对核糖体的性质和功能缺乏了解，因而举步维艰。Crick认为，假说中细胞质“RNA模板”“显然”位于微粒体颗粒（即核糖体）。Crick假设每个核糖体都是由一个统一的蛋白质结构和一个独特的RNA序列组成，RNA是合成特定蛋白质的模板。Crick的这个观点，部分基于Mahlon Hoagland和Paul Zamecnik的发现在蛋白质合成过程中，放射性标记的氨基酸最初仅存在于核糖体中，这强烈表明氨基酸必须通过核糖体才能结合成蛋白质。这么看来，核糖体中的RNA很可能是制造蛋白质的模板。 为了解释每个氨基酸如何到达核糖体，Crick提出假说，即存在所谓的“适配器”（the adaptor）：一组小的、高度不稳定的 RNA 分子，它将每个氨基酸带到核糖体，让核糖体产生蛋白质。同一时间，Hoagland和Zamecnik在对Crick假说不知情的情况下找到了这种RNA。我们今天称之为“转移RNA”（transfer RNA，tRNA）。Crick解释说，细胞质中必须至少有两种RNA。一种RNA位于核糖体内部，他把它叫做“模板RNA”（template RNA），还有一种RNA是每种类型的核糖体根据“模板RNA”合成的“代谢/可溶性RNA”（metabolic or soluble RNA）。从形式、功能或位置上来看，它们都不是我们现在所说的mRNA。Francis Crick头脑再聪明，也没有认识到还需要第三种形式的RNA。回想起来，20世纪50年代有一些结果已暗示了存在基因产生作为中介的短命RNA，即我们所知的mRNA25。然而，要么结果不支持推测性的结论，要么是结果被错误地诠释。基本上这些文章现在只有历史学家还记得。当然可能还有其他一些结果，有待被重新发现。1950 年，布鲁塞尔大学的Jeener和Szafarz试图识别不同RNA片段中的差分更新（differential turnover）。他们受限于相对原始的技术。然而，他们提出假说，认为RNA在细胞核中合成，然后以小分子的形式进入细胞质，在那里它与“大尺寸的细胞质颗粒”整合，然后消失26。1958 年，Jeener证明RNase在细菌细胞感染后阻止了噬菌体蛋白的合成，并得出结论：“快速更新的RNA是感染的特定产物，在噬菌体蛋白的合成中发挥作用”。 1952年和1954年，Monod团队28和Arthur Pardee29团队分别表明，在突变细菌中，-半乳糖苷酶的合成需要存在特定RNA的核苷酸尿嘧啶，这表明RNA合成是蛋白质合成所必需的。他们的结论（也是Crick的结论）仅仅表明，细胞质中至少有一些RNA更新了。  1953年，Al Hershey的研究小组表明，细菌感染噬菌体后不久会产生一种RNA，这种 RNA既能高速合成，也能迅速分解。然而，这可能是感染的病理结果。   1956年，Elliot 'Ken' Volkin（图 2）和Lazarus Astrachan使用放射性磷表明，大肠杆菌细胞被噬菌体感染后，RNA部分中出现放射性，其碱基组成与正常情况下大肠杆菌产生产生的RNA非常不同 31。他们的实验并没有揭示任何关于RNA功能的信息。Volkin和Astrachan倾向于认为，这种RNA的短暂存在形态是DNA的前体。  1958年，Volkin和Astrachan发现，虽然细菌在噬菌体感染后，迅速出现放射性RNA，但如果晚点添加同位素，则在DNA中的放射性比RNA中的更高。他们对这些结果的解释，还是在于RNA如何作为DNA合成的前体。人们对他们的研究结果很感兴趣Thomas Duke回忆当他们1956年FASEB会议上展示这些发现时，房间里挤满了人，自己只能在门口听。1958年Monod组织的会议上，Volkin发表了演讲。不过，将他们的发现解释为“类DNA的RNA”，掩盖了这些结果的重要性。    1960年，Nomura、Hall和Spiegelman改进Volkin和Astrachan的方法，表明噬菌体感染后有两种形式的RNA被合成：一种在核糖体的部分，另一种在可溶性RNA中。他们解释可溶性RNA：要么是核糖体RNA（或其分解产物）的前体，要么参与“氨基酸接受正常可溶性RNA”，换句话说，类似于Crick提出的适配器分子。 然而，当Nomura等人在对论文进行最后润色的同一时间，一次思想突破发生了，确凿无误地确认了mRNA。那是在剑桥的一次非正式讨论，几乎已经一个传奇了。在某些科学发现中，瞬间脑力激荡的作用真不小。巴黎的科学家首先意识到基因产生信使分子。Arthur Pardee1957年开始休学术假，访问巴斯德研究所。Pardee正在与Jacques Monod研究诱导的遗传基础。细菌放到含有乳糖的培养基上后会开始合成-半乳糖苷酶。突变的lac细菌无法在乳糖上生长，除非它们获得编码 -半乳糖苷酶的z+ 基因。Pardee表明，当z+基因被转移到 lac- 细菌个体中，-半乳糖苷酶的合成会在几分钟内开始。这意味着有一个直接的化学信号，从引入的基因直接传递到宿主细胞的蛋白质合成系统。接下来的一年左右，巴黎的小组开始关注这种神秘的信使分子的性质，他们称之为X（英国和美国的科学家，也按照法语来发音“eex”）。 1958年春天，物理学转行的生物学家Leo Szilárd访问巴斯德研究所后，Pardee、Jacob和Monod开始思考，这并非是一种诱导（induction），而是“去抑制”(de-repression)换句话说，-半乳糖苷酶的合成通常受到抑制，但乳糖的存在以某种方式释放了这种抑制。他们的发现被称为PaJaMo（或者，更准确地说，PaJaMa）实验，以参与其中的三个人的名字命名。1958年8月，Jacob突然开窍，团队开始推测，诱导之所以发生，是因为对抑制基因（repressor gene）的直接作用，要么停止了抑制基因活性，要么阻止了抑制基因的产物。1959年，他们发表实验和解释的完整版本，将作用于阻遏基因的物质称为“细胞质信使”（cytoplasmic messenger）。但是这个过程究竟是如何运作的，尤其是信使是由什么组成的，他们无法说清楚。巴斯德研究所与Crick和Brenner周围的剑桥小组之间的关系融洽，但两个团队研究截然不同的问题，因此很少在非正式场合讨论工作。正如Brenner后来回忆的那样，“你看，巴黎人对调节（regulation）很感兴趣。我们基本上对编码（code）感兴趣。所以我们方法稍微不同”。这两种方法最终在1960 年4月15日耶稣受难日发生碰撞。当时Crick和Jacob等一小群研究人员聚集在剑桥国王学院Brenner的房间里。前一天在伦敦举行的会议结束了，现在是一场非正式的“事后”会议。一组人聊天时，Jacob向大家说明在巴黎得到的最新结果，他重点说了使细胞产生-半乳糖苷酶的z+基因被引入细胞后快速合成大量酶。巴黎小组已考虑过有一种可能性，即该基因编码了一种非常有效的核糖体，然后以高速率生产出这种酶。但Jacob接着说，Pardee最近做了一项实验，表明该基因没有产生稳定的核糖体，而只会产生短暂的信使分子“X”。Crick回忆“那一刻，Brenner大叫起来他已经看到了答案”。Jacob生动地描述了接下来的几分钟：“Francis和Sydney跳了起来，开始打手势，激烈地争辩。Francis红着脸，Sydney眉毛竖起。两人同时说话，几乎是大喊大叫。每个人都试图预测对方。向对方解释一下自己突然想到的事情。所有这些都在瞬间发生，我的英语远远无法描述”。在那一刻，Brenner和Crick意识到，神秘的PaJaMo信使可以解释Volkin和 Astrachan等人的结果，这些结果表明，在噬菌体感染后，细菌会产生一种存活时间很短的RNA，其碱基组成与噬菌体DNA相同，且与宿主核糖体RNA不同。这两个剑桥人立即抓住了可能性：这个短命的RNA或许是神秘的巴黎信使。如果这样，核糖体就是细胞中的惰性结构Crick将其类比为磁带录音机中读磁头（reading head）。当年秋天，Jacob和Monod命名它为“信使RNA”（很快被缩写为 mRNA）。它就像一条磁带，从DNA中复制出信息，然后将这些信息传送到核糖体，核糖体读取它并按照指示制作适当的蛋白质。这个磁带录音机的比喻在21世纪显得古怪，可能还需要向今天的学生做解释。但在当时，它是一个前沿的比喻，用最新的技术发展来解释一种新的生物现象。 Jacob和Brenner立即开始计划，如何检验这个假设。那天晚上，Crick夫妇又一次举行派对。Jacob清楚地回忆起当时的情景：   “一个非常英式的夜晚，有剑桥的精英，有很多漂亮的女孩，各种各样的饮料，还有流行音乐。然而，Sydney和我太忙太兴奋了，无法积极参加庆祝活动在如此精彩、热闹的聚会中，我们很难孤立自己，所有人都围在我们周围，有说有笑、有笑声、有歌声，跳舞。尽管如此，我们还是像在荒岛上一样挤在一张小桌子旁边，继续按照自己兴奋的节奏，讨论我们的新模型和实验的准备工作Sydney愉快地用计算和图表填满整页纸。有时Francis会探出头，说说我们必须做什么。偶尔我们中有个人会出去喝酒和吃三明治。然后我们的二重奏再次开始”分离mRNA Jacob和Brenner提议的实验，需要用到Matt Meselson在帕萨迪纳加州理工学院的超速离心机。实验挑战在于想搞明白，究竟信使参与产生了新的核糖体，还是信使由瞬时形式的RNA构成（RNA只是利用旧的宿主核糖体将其信息转化为蛋白质）。在加利福尼亚度过了紧张的一个月，Jacob、Brenner和Meselson不停地调试实验条件（镁浓度被证明是决定性的），终于成功开展了实验。如他们所预期的那样，新的核糖体没出现。噬菌体DNA中复制出小的、短暂存在的RNA，它与细菌宿主中已经存在的旧核糖体产生联系。这就是信使RNA。 故事很戏剧化，但它并不是发现信使RNA的必要条件。其他研究人员独立开展研究，他们没那么兴奋，也少点洞察力，却也从不同的途径得出了相同的结论。他们的发现途径表明，即使未曾发生耶稣受难日的思想碰撞，科学家在那个时期前后也能分离出mRNA。Jim Watson了解哈佛大学的Robert Risebrough的工作，所以他认为蛋白质合成是由于“无特定基因”（genetically non-specific）核糖体与临时“模板”RNA 分子发生作用。Watson和Risebrough、巴斯德研究所的François Gros和Howard Hiatt、哈佛大学的Charles Kurland和Wally Gilbert，合作开始了一系列实验。他们发现，曾短暂暴露于放射性标记RNA前体的细胞中，存在短暂存在的RNA分子。Watson他们的实验花了很长时间，几乎要被别人捷足先登了。Watson听到Jacob、Brenner和Meselson向自然期刊提交了他们的论文后大怒，他1961年2月发了一封电报，要求Brenner在自己发表前暂缓发表（图 3）。三人大方地答应了Watson的请求，两篇文章背靠背刊登。图3 Watson的电报与此同时，Jacob和Monod以Brenner-Jacob-Meselson实验未发表的结果为基础，于1960年12月提交一篇长综述，其中描述了他们所称“信使 RNA”的潜在作用。它发表在1961年5月的分子生物学杂志（Journal of Molecular Biology）上，与自然的两篇文章同时出现。 Jacob和Monod的综述内容量很大，优雅且富有远见。他们概述了对结构基因和调节基因的理解，然后专注于细胞质信使“X”的性质。他们审查广泛证据（几乎所有证据都来自对细菌或噬菌体的研究），提出了信使性质的五个标准：它是多核苷酸；其分子量应因情况而异；它的碱基组成应反映产生它的 DNA的组成；它应该至少暂时与核糖体有关联；它应该有很高的周转率。核糖体RNA和tRNA不符合这些要求，而Volkin和Astrachan以及最近Yas和 Vincent在酵母中报道的瞬时RNA似乎是一个很好的候选者。Jacob和Monod将这种RNA组分称为“信使RNA”，他们最初将其缩写为“M-RNA”。选择“信使”这个用词意义重大，这表明Jacob和Monod并没有从类似的模板分子的角度进行思考，而是开始从信息的角度看待问题。信息的形式不是重点他们强调的是它的意义或功能。 1960年12月初，Sol Spiegelman和Benjamin Hall向PNAS 提交了一篇文章，表明在T2噬菌体中，DNA和瞬时RNA 显示出序列互补性并会发生杂交。Crick于1957年首次编纂了信息从DNA到RNA 的传递途径，该途径已被证明是存在的。基因功能和蛋白质合成的主要概念组件，科学家已经有了。但还没有人证明，该系统确实有效。 在Jacob和Monod的论文提交之前，位于贝塞斯达（Bethesda）的国家关节炎和代谢疾病研究所（National Institute of Arthritis and Metabolic Diseases）里有一位默默无闻的研究人员也在考虑信使RNA。Marshall Nirenberg研究石蝇获得生物学硕士学位后又获得生物化学博士学位。申请Monod团队的博后职位被拒后，Nirenberg在贝塞斯达找到了一个职位，与魅力非凡的爵士乐狂热者Gordon Tomkins一起工作。Tomkins当时35岁，只比Nirenberg略资深。Nirenberg最初研究诱导。看到Paul Zamecknik和 Severo Ochoa的“无细胞”（ cell-free in vitro）蛋白质合成的发展，他将注意力转向蛋白质合成的性质和遗传密码。Nirenberg保留了一系列引人注目的实验日记，其中记录了他的想法和灵感。1960年11月末，Nirenberg的日记充满了关于无细胞系统、信使RNA的重要性以及使用合成RNA作为关键的讨论：“你能用信使RNA淹没系统吗？”（ “Can you swamp system with messenger RNA?” ）他写道。目前尚不清楚Nirenberg是从哪里了解到这个术语的它尚未发表，唯一使用该短语提交的论文是Brenner-Jacob-Meselon论文，而Nirenberg似乎并不知道这篇论文7。尽管Nirenberg不是分子生物学核心圈子的一部分，但“信使 RNA”这个词在会议上被广泛流传，因此他有可能直接或通过参加其中一次会议的人听到的。然而，Nirenberg显然并没有完全理解巴黎、剑桥、加州理工学院和哈佛大学的研究人员所描述的三种RNA。直到1960年12月，Nirenberg的日记显示，他仍然持有蛋白质合成发生在DNA分子的观点。大多数科学家几年前就已经放弃了这个观点。1961年3月，Nirenberg和他的博士后Heinrich Matthaei向快速出版的期刊 生物化学和生物物理研究通讯（Biochemistry and Biophysical Research Communications）42 提交了一篇文章。在这篇论文中，他们描述了他们的无细胞蛋白质合成系统的结果，强调他们所谓的核糖体RNA和可溶性RNA 必须同时存在才能使实验进行；可溶性RNA本身不能驱动蛋白质合成。通过分级分离核糖体RNA，他们发现，有一部分的沉淀速度大约是可溶性RNA的三倍。类似大小的与核糖体连接的RNA分子，1961年初Aronson和McCarthy也描述过，但它们被看成核糖体前体或分解产物。Matthaei和Nirenberg虽然也困惑，但观点更尖锐，他们总结说：“我们研究中使用的部分或全部核糖体RNA可能对应了模板RNA或信使RNA”。尽管使用了“信使RNA”这个术语，但似乎Nirenberg仍然想知道核糖体是否是信使这正是 Brenner-Jacob-Meselson实验旨在解决的问题。令人惊讶的是，Nirenberg从未引用过这篇文章（仅被引用了 14 次）；第一个引用它的人是Jim Watson，在他1962年的诺贝尔奖演讲中（他把作者弄错了）。尽管有人认为这篇文章表明Nirenberg第一个分离了mRNA，但无论是讨论还是数据都不能证明这一说法是正确的。它表现出，围绕着蛋白质合成和基因功能中缺失的环节（信使RNA）展开的结果和技术，是多么错综复杂。描述mRNA的性质和功能的自然和分子生物学杂志的副本送达世界各地的信箱和图书馆。此时的Heinrich Matthaei正在进行一项关键实验，该实验将读取遗传密码并实际演示mRNA的功能。他和Nirenberg已经证明，系统中添加烟草花叶病毒RNA后，蛋白质以惊人的速度被大量生产。遵循 Nirenberg过去几个月在实验室日记中精心安排的实验计划，Matthaei 完成了实验的最后一步。实验表明，如果将仅由尿嘧啶 ('poly U') 组成的合成 RNA分子添加到细胞中，系统会产生聚苯丙氨酸（polyphenylalanine）。遗传密码已被破解嘧啶会编码组合成为苯丙氨酸。1961年8月，莫斯科举行了国际生物化学大会。这些不知名的研究者所取得的突破在会上首次宣布。初秋，Nirenberg和Matthaei在PNAS上描述了这些结果，这篇文章再次提到了“信使 RNA” ，但核糖体RNA和我们所说的 mRNA之间的混淆仍然存在，且在他们的实验中并没有提到 poly(U) RNA 具有mRNA 的功能。此外，他们没有引用最近发表的三篇首先使用mRNA一词的论文中的任何一篇（两篇 Nature 论文，Jacob和Monod的综述）。事实上，不知什么原因，Nirenberg从未引用过这三篇文章中的任何一篇。Nirenberg和Matthaei的革命性发现，彻底改变人们研究蛋白质合成和遗传密码的方式。这一发现加上人们对mRNA的确认，改变了我们对生命的思考。一旦我们获得理解，很多事情就都说得通了。1961年的那几个月，为随后的一切奠定了基础，永远改变了我们的理解。学科网（北京）股份有限公司