(31)--实验：质粒提取实验生物化学与分子生物学.ppt

质粒质粒DNA的提取的提取及及琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测1实验内容实验内容n一、一、碱裂解法小量制备质粒碱裂解法小量制备质粒DNAn二、二、琼脂糖凝胶电泳检测琼脂糖凝胶电泳检测DNAn实验学时：实验学时：8 学时学时n实验类型：综合性实验类型：综合性n每组人数：每组人数：23 人组人组2实验目的实验目的掌握碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶掌握碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的原理电泳的原理熟悉碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶熟悉碱裂解法提取质粒和琼脂糖凝胶电泳的操作过程电泳的操作过程了解质粒的其他提取方法及质粒了解质粒的其他提取方法及质粒在基因工程中的应用在基因工程中的应用3一、碱裂解法小量制备质粒一、碱裂解法小量制备质粒DNADNA1.实验背景实验背景质粒（质粒（plasmid）是细菌细胞内一种自我复自我复制的环状双链制的环状双链DNA分子分子，能稳定地独立独立存在于染色体外染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。451.实验背景实验背景1、部位不同：、部位不同：2、大小不同：、大小不同：质粒分子量较小，大小只有质粒分子量较小，大小只有普通细菌染色体普通细菌染色体DNA的百分之的百分之一。一。基因组基因组DNA分子量较大，细分子量较大，细菌基因组约含菌基因组约含3000个基因。个基因。质粒质粒DNA与基因组与基因组DNA区别区别1.实验背景实验背景n大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的双链、共价闭合环状的分子分子，以超螺旋超螺旋形式存在；质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，称为开环开环DNA；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状线状DNA。n当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺超螺旋旋形式的泳动速度要比开环开环和线状线状分子的泳动速度快。6以以pEGFP-N1质粒为例质粒为例筛选标记筛选标记MCS（多克隆位点）（多克隆位点）复制原点复制原点7实验背景实验背景质粒的特点质粒的特点筛选标记筛选标记 多克隆位点多克隆位点 复制原点复制原点81.实验背景实验背景质粒的应用质粒的应用91)培养细菌使质粒扩增；培养细菌使质粒扩增；2)收集裂解细菌；收集裂解细菌；3)分离纯化质粒分离纯化质粒DNA。质粒提取有多种方法，但都包含质粒提取有多种方法，但都包含有有3个基本步骤：个基本步骤：去除蛋白质去除蛋白质*酚酚-氯仿抽提法氯仿抽提法去除去除RNA*RNase消化消化去除基因组去除基因组DNA形成复合物形成复合物n2.2.质粒提取的步骤质粒提取的步骤103.3.质粒提取方法的选择质粒提取方法的选择决定使用不同的方法决定使用不同的方法质粒的量质粒的量质粒的纯度要求质粒的纯度要求质粒的大小质粒的大小大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法质粒过大：质粒过大：温和裂解法温和裂解法质粒大小适中：质粒大小适中：碱裂解，碱裂解，煮沸法煮沸法11 4.4.实验原理实验原理(碱裂解法碱裂解法)高碱高碱细菌的细胞壁破裂，内容物释放细菌的细胞壁破裂，内容物释放染色体染色体DNADNA断裂成不同长度的线性双链断裂成不同长度的线性双链DNADNA；线性双链线性双链DNADNA片段中的氢键断裂，双链解离变性。片段中的氢键断裂，双链解离变性。质粒质粒DNADNA不发生断裂，保持双链闭合环状；不发生断裂，保持双链闭合环状；双链双链DNADNA并不完全分离。并不完全分离。高酸高酸中和中和至中至中性性变性的染色体变性的染色体DNADNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物网络状大分子不溶性沉淀物质粒质粒DNADNA又恢复天然构型，溶解在上清液中又恢复天然构型，溶解在上清液中纯化纯化RNARNA酶消化除去酶消化除去RNARNA，并用酚抽提法除去残留的蛋白质，并用酚抽提法除去残留的蛋白质原理解读原理解读n强碱和强碱和SDSSDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNADNA在碱性条件下发生变性。在碱性条件下发生变性。怎样去除基因组怎样去除基因组DNA？当当加加入入酸酸性性物物质质进进行行中中和和时时，质质粒粒DNA很很快快复复性性，染染色色体体DNA则则和和变变性性蛋蛋白白质质等等缠缠绕绕在在一一起起难难以以复复性性而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；而形成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；怎样去除蛋白质？怎样去除蛋白质？留留有有质质粒粒DNA的的上上清清，经经酚酚和和氯氯仿仿去去除除蛋蛋白白质质后后,用用乙醇乙醇沉淀质粒沉淀质粒DNA，即得到质粒，即得到质粒DNA.13一、培养细菌使质粒扩增一、培养细菌使质粒扩增碱裂解法提取质粒操作步骤碱裂解法提取质粒操作步骤14加入加入200 l预冷的细胞悬浮液（溶液预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌；）悬浮细菌；二、细菌的裂解二、细菌的裂解细胞悬浮液（溶液细胞悬浮液（溶液I）25 mmol/L Tris.HCl PH 8.0任何生物化学反应，首先要控制好溶液任何生物化学反应，首先要控制好溶液pH50 mmol/L 葡萄糖葡萄糖悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管的底部悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管的底部10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0二价金属离子的螯合剂：抑制二价金属离子的螯合剂：抑制DNase的活性的活性和微生物生长。和微生物生长。15加入加入200 l细菌裂解液（溶液细菌裂解液（溶液II），颠倒混合离心），颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。管内容物，待溶液变粘稠为止。注：注：粘稠粘稠：开盖后出现拉丝现象，证明：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。已经游出。二、细菌的裂解二、细菌的裂解0.2mol/LNaOH保证保证NaOH没有吸收空气中的没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。细胞膜从双层膜而减弱了碱性。细胞膜从双层膜结构向微囊结构转变裂解。结构向微囊结构转变裂解。1%SDS16三、中和及去除蛋白质、细胞壁和基因组三、中和及去除蛋白质、细胞壁和基因组DNA加入加入150 l中和液，上下颠倒混合后置冰上中和液，上下颠倒混合后置冰上5min，12,000转转/分，分，4离心离心5min。中和液（溶液中和液（溶液III）-中和中和NaOH60 ml 5mol/L 醋酸钾醋酸钾11.5ml 冰醋酸冰醋酸28.5ml 水水长时间的碱性条件会打断长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。，所以要中和。SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾PDS，PDS和蛋白质、细胞壁和基因组和蛋白质、细胞壁和基因组DNA形成复合物沉淀。形成复合物沉淀。17四、彻底去除蛋白质和细胞碎片四、彻底去除蛋白质和细胞碎片 将上清移至另一离心管中，加入等体积的酚将上清移至另一离心管中，加入等体积的酚/氯仿氯仿/异戊醇异戊醇(25：24:1)溶液，振荡混匀溶液，振荡混匀1min，12,000转转/分分离心离心 5min。将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀溶液，振荡混匀1min，12,000转转/分分 离心离心 5min。酚：酚：用酚来最大程度将蛋白质抽提掉；用酚来最大程度将蛋白质抽提掉；氯仿：氯仿：增加比重，使得酚增加比重，使得酚/氯仿始终在下氯仿始终在下层，方便水相回收；层，方便水相回收；异戊醇异戊醇：消泡剂，让界面更加清晰，方：消泡剂，让界面更加清晰，方便水相回收。便水相回收。18将上层水相移至另一离心管中，加入将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积的无水乙醇，倍体积的无水乙醇，置置-20沉淀沉淀1015min。12,000转转/分离心分离心5min。弃上清，。弃上清，室温干燥质粒室温干燥质粒DNA5-10min。DNA溶液是溶液是DNA以水合状态稳定存在，以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的周围的水分子，使水分子，使DNA失水而易于聚合。失水而易于聚合。五、沉淀五、沉淀DNA19六、去除六、去除RNA 用用20 l含含RNase的的水溶解质粒水溶解质粒DNA，轻轻吹，轻轻吹打混合打混合。37 保温保温10min继续实验操作继续实验操作20商业化质粒提取试剂盒商业化质粒提取试剂盒21质粒质粒DNA的浓度测定的浓度测定计算公式：计算公式：1.0OD260nm=50ug/mlDNA质粒质粒DNA(ug/ml)=50OD260nm稀释倍数稀释倍数22n一一、琼脂糖凝胶电泳原理、琼脂糖凝胶电泳原理DNA分子在碱性缓冲液中带分子在碱性缓冲液中带负电荷负电荷，在外，在外加电场作用下向加电场作用下向正极正极泳动。泳动。不同不同DNA的的分子量大小及构型分子量大小及构型不同，电泳不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。nDNA分子的分子的迁移速度迁移速度与分子量的对数值成与分子量的对数值成反比关系。反比关系。质粒质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳23、n二二、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳琼琼脂脂糖糖是是一一种种海海藻藻多多糖糖，结结构构单单元元是是 D-半半乳乳糖糖和和3.6-脱脱水水-L-半半乳乳糖糖。通通过过改改变变琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶的的浓浓度度，可可以以分分离离200到到50,000 bp 大小的大小的 DNA 片断片断。质粒质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳24、琼脂糖凝胶缓冲液琼脂糖凝胶缓冲液适用于双链适用于双链DNA的电泳缓冲液的电泳缓冲液uTris-乙酸盐和乙酸盐和EDTA缓冲液（缓冲液（TAE）uTris-硼酸盐缓冲液硼酸盐缓冲液(TBE)uTris-磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液(TPE)25三三、琼脂糖凝胶操作步骤、琼脂糖凝胶操作步骤1.根据电泳需要，配置合适浓度的电泳根据电泳需要，配置合适浓度的电泳及制胶缓冲液。一般为及制胶缓冲液。一般为1TAE或或0.5TBE。2.根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准量的电泳缓冲液的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。确称量的琼脂糖粉。注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的液必须是相同的。注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。容量。26注意：注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。会造成电泳图像模糊不清。注意：注意：加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。微波炉中加热时间不宜过长。加热。微波炉中加热时间不宜过长。注意：注意：由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上由于蒸发作用，溶解前在容量瓶上作一个记号，溶解后用三蒸水补足。作一个记号，溶解后用三蒸水补足。273.在微波炉中加热溶解琼脂糖。在微波炉中加热溶解琼脂糖。4.使溶液冷却至使溶液冷却至60左右，如需要可在左右，如需要可在此时加入溴化乙锭此时加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度溶液使其终浓度为为0.5ug/ml，并充分混匀。，并充分混匀。5.将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在将琼脂糖溶液倒入制胶模中，然后在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在适当位置处插上梳子。凝胶厚度一般在35mm之间。之间。注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有注意：溴化乙锭是一种致癌物质。使用含有溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭溴化乙锭的溶液时，请戴用手套。溴化乙锭在可见光下会分解在可见光下会分解。注意：不要产生气泡，影响电泳效果。注意：不要产生气泡，影响电泳效果。28注意注意：凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶不立即使用时，用保鲜膜将凝胶包好在凝胶包好在4下保存，或者放在制胶的下保存，或者放在制胶的缓冲液中，一般可保存缓冲液中，一般可保存25 天。天。电泳缓冲液刚好电泳缓冲液刚好没过凝胶没过凝胶1mm为好为好，太，太多则电流加大，凝胶发热。多则电流加大，凝胶发热。296.在室温下使胶凝固（大约在室温下使胶凝固（大约30分钟），分钟），然后放置于电泳槽中进行电泳。然后放置于电泳槽中进行电泳。取取10 l的质粒的质粒DNA加加2 l上样液混匀。上样液混匀。加到加到1%琼脂糖凝胶的加样孔内。琼脂糖凝胶的加样孔内。电泳条件：电泳条件：100V40min。电泳结束后照像保存，结果分析。电泳结束后照像保存，结果分析。30、7.LoadingDNAsamples(加样加样)用移液枪缓慢将用移液枪缓慢将DNADNA样品垂样品垂直加入加样孔直至开口下方。直加入加样孔直至开口下方。1.1.DNAsamples：10l2.Loadingbuffer(6X)：2l3.DNAmarkers：6lTotal12l31接接通通电电泳泳槽槽与与电电泳泳仪仪的的电电源源(注注意意正正负负极极，DNA片片段段从从负负极极向向正正极极移移动动)。保保持持电电压压 60-80 V。当当溴溴酚酚蓝蓝染染料料移移动动到到距距凝凝胶前沿胶前沿1-2cm处，停止电泳。处，停止电泳。328.电泳电泳质粒的电泳图质粒的电泳图质粒质粒DNA的的3种形式泳动速度种形式泳动速度:超螺旋超螺旋线性线性开环开环质粒质粒DNA的存在形式有的存在形式有3种种:1、共价闭环共价闭环DNA:常以超螺旋常以超螺旋形式存在形式存在 2、开环开环DNA:质粒质粒DNA两条链两条链中有一条发生一处或多处断裂，中有一条发生一处或多处断裂，因此可以自由旋转从而消除张因此可以自由旋转从而消除张力力,形成松弛的环状分子形成松弛的环状分子 3、线性线性DNA:因质粒因质粒DNA的两的两条链在同一处断裂而造成条链在同一处断裂而造成.开环开环超螺旋超螺旋线性线性33