(10)--质粒提取生物化学与分子生物学实验.ppt

质粒的提取和电泳鉴定01实验原理03实验步骤02所用试剂和器材目录04注意事项 质粒简介：闭合双链DNA；存在于细菌的细胞质中、独立于染色体之外可主复制的遗传成份。一、实验原理质粒对细菌具有重要意义一、实验原理一、实验原理菌体在NaOH和SDS溶液中裂解，蛋白质与DNA发生变性；加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，且呈溶解状态，离心后位于上清液中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心后沉淀；将质粒纯化。碱裂解法小提质粒简介一、实验原理u琼脂糖凝胶-均匀介质，胶的浓度不同导致其孔径不同，达到不同的分离效果；uDNA-带负电，电泳的快慢与分子大小和形状有关；uMarker-DNA分子大小的标尺；u上样缓冲液-沉降DNA、指示作用。质粒的检测方法：琼脂糖凝胶电泳简介空气震荡摇床，离心机，微量移液器，枪头，EP管，涡旋混匀器，水浴锅。试剂I，试剂II，试剂III，无水乙醇，70%乙醇，TE溶液，菌液,RNase，乙酸钠。二、仪器设备及耗材三、试剂四、操作步骤1、细菌转化取10L质粒加入到100L感受态菌体中，冰浴30min42，90 S冰浴，2.5 min加800 L LB培养基摇床，50 min6000 rpm X5 min涂布37恒温培养四、操作步骤2、挑菌 37剧烈振摇培养12小时左右 挑取单菌落放到含相应抗生素的LB培养基中四、操作步骤3、细菌的收集1.2 mL菌液于1.5 mL EP管中10000 rpm离心30 s弃去上清液，使细菌沉淀尽可能干燥四、操作步骤4、细菌的裂解100 L溶液重悬细菌200 L溶液颠倒混匀150 L溶液混匀后静置3min10000 rpm 离心5min四、操作步骤5、质粒DNA的回收转移上清液到新的EP管中，加2倍体积无水乙醇，1/10体积乙酸钠10000rpm离心5min1mL 70乙醇10000rpm 离心2min弃去乙醇晾干515min50 L TE 1 L RNase37水浴5 min贮存于-20四、操作步骤6、琼脂糖凝胶电泳（1）制备凝胶0.4 g琼脂糖50 ml TAE微波炉内溶解准备好模具1:10000添加荧光染料倒入模具，等待凝固四、操作步骤6、琼脂糖凝胶电泳（2）上样、电泳和观察10 l 质粒溶液与 1.5 l上样缓冲液混匀上样完成后电压100 V 电泳溴酚蓝距凝胶边缘2cm停止电泳，于254nm紫外光观察将凝胶放置于电泳槽中注意事项1、转化操作过程中，感受态细胞需要在冰上融化，加入质粒后轻轻混匀；2、提质粒加入溶液II和溶液III时，需要轻轻颠倒混匀，不要剧烈震荡；3、制备琼脂糖凝胶过程中，摇晃不要太剧烈；加入染料时温度不能太高；倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀；速度也不可太快，否则容易出现气泡。感 谢 聆 听