细胞破碎和生化分离技术-PPT.pptx

细胞破碎和生化分离技术固液分析技术过滤 过滤就就是利用多孔性介质截留固液悬浮物中得固体颗粒,从而实现固液分离得方法。深层过滤 滤饼过滤 滤饼阻力主要由菌种和发酵条件决定改善过滤性能得方法 过滤操作得两个目标:加快过滤速率、提高过滤质量。絮凝 助滤剂 反应剂 酶解过滤设备及选择依据推动力;常压过滤机、加压过滤机、真空过滤机依据设备构造:板框压滤机、鼓式真空过滤机、加压叶滤机微滤 微滤就是一种以多孔细小薄膜为过滤介质,以压差为推动力,使不溶物质浓缩过滤得操作。微滤分离过程得三阶段。影响分离速率得因素主要有操作形式、流速、压力和料液浓度。微滤技术有着广泛应用和众多得优点。微滤得操作模式 无流动操作模式和错流过滤操作模式微滤设备 板框式膜过滤器 管式膜过滤器 中空纤维式膜分离器 螺旋卷式膜分离器离心技术 一、离心分离得基本原理 二、离心机得类型 三、离心方法 四、离心条件得确定 五、影响离心效果得主要因素与控制优点:分离速度快,分离效率高、液相澄清度好;缺点:与过滤设备相比 与过滤设备相比,设备投资高、能耗大、离心产生得固体浓缩物和过滤产生得浓缩不同。通常情况下离心只能得到一种较为浓缩得悬浮液或浆体。而过滤可获得得水分含量较低得滤饼。离心分离离心得原理 对于浓度较小 对于浓度较小,粒径较大 粒径较大,硬度较强得不溶物 硬度较强得不溶物,可以采用过 可以采用过滤分离。滤分离。但当固体颗粒细小而难以过滤时 但当固体颗粒细小而难以过滤时,发酵液不易被过滤纯化 发酵液不易被过滤纯化,离心操作往显得十分有效。离心操作往显得十分有效。离心分离:就是借助于离心机旋转所产生得离心力,使不同大小、不同密度得物质分离得技术过程。大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点 可以互相讨论下，但要小声点差速离心离心机得类型 据分离方式分:沉降式离心机、过滤式离心机 据操作方式分:间歇式(分批)离心机、连续式离心机 据转速分:常速离心机(低速离心机)、高速离心机、超速离心机 据设备结构特点分:管式、蝶式、螺旋式 按速度和离心力:1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离;2、高速(冷冻)离心机 11042、5104rpm,相对离心力104105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离;3、超速离心机 转速2、58104rpm,相对离心力5105g;用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化;检测纯度;沉降系数和相对分子量测定等。离心机得种类与用途离心方法 对于常速离心机和高速离心机,由于所分离得颗粒大小和密度相差较大,只要选择好离心速度和离心时间,就能达到分离效果;如果希望从样品液中分离出2种以上大小和密度不同得颗粒,需要采用差速离心方法。而对于超速离心,则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方法。大容量冷冻离心机据设备结构特点分1 斜角式2 平抛式3 管式4 蝶片式5 螺旋式6 多室式斜角式离心机v 就是一类结构最简单得实验室常用离心机,v 指离心管腔与转轴成一定倾角得转子;v 角度越大,沉降越结实,分离效果越好,v 角度越小,颗粒沉降距离短,沉降速度快,但分离效果差。v 颗粒在角转子中沉降时,先沿离心力方向撞向离心管,然后再沿管壁滑向管底,因此管得一侧会出现颗粒沉积。平抛式离心机v平抛式离心机一类结构简单得实验室常用得低中速离心机,转速一般在 3000-6000rpm。v 转子活动管套内得离心管,静止时垂直挂在转头上,旋转时随着转子转动,从垂直悬吊上升到水平位置(约200800rpm)。v颗粒在水平转子中得沉降就是沿管子轴向移动。v样品便于收集v受振动和变速搅乱后对流现象小,v但转头结构复杂,最高转速相对要低v容量也小一些。平抛式离心机转子 管式离心机具有一个细长而高速旋转得转鼓,转鼓内装有纵向平板,其下部有进料口。上部两侧有重液相和轻液相出口(对液液分离而言)。分为液液分离得连续式管式离心机和液固分离得间歇式管式离心机。管式离心机液液分离管式离心机 液固分离管式离心机液固分离管式离心机 待处理得物料在一定压力(3104 Pa左右)下由进料管经底部空心轴进入鼓内,靠挡板分布于鼓得四周,并使料液迅速达到与转鼓相同得角速度。转鼓带动物料高速旋转,在离心力下,悬浮液沿转鼓内壁向上流动得,料液在离心力场得作用下因其密度差得存在而分离。澄清后得液相流动到转鼓上部得排液口排出。比重大得固体微粒逐渐沉积在转鼓内壁形成 沉渣层,达到一定数量后,停机人工清除。管式离心机特点:结构简单,可提供较大离心力,转速高,效果好。管状离心机可以冷却,有利蛋白质分离 对于间歇操作式,须定时拆卸、清洗 适用于分离乳浊液及含细颗粒得稀悬浮液,适用于固体含量低于1%,颗粒度小于5微米,黏度大得悬浮液澄清或固液两相密度差较小得分离。碟片式离心机 就是在管式离心机得基础上发展起来得,在转鼓中加入了许多重迭得碟片,缩短了颗粒得沉降距离,提高了分离效率。就是生物工业中应用最为广泛得一种离心机 有一个密封得转鼓,内装十至上百个锥顶角为60-100锥形碟片。碟片间得距离一般为0、5-2、5mm。碟片式离心机工作原理 当悬浮液在动压头得作用下,经中心管流入高速旋转得碟片之间得间隙时,便产生了惯性离心力,其中密度较大得固体颗粒在离心力作用下向上层碟片得下表面运动,而后在离心力作用下被向外甩出,沿碟片下表面向转子外围下滑,而液体则由于密度小,在后续液体得推动下沿着碟片得隙道向转子中心流动,然后沿中心轴上升,从套管中排出,达到分离得目得 碟片式离心机类型 人工排渣得碟片离心机 碟片上不开孔,只有一个清液排出口。沉积在转鼓内壁上得沉渣,间歇排出。只适用于固体颗粒含量很少得悬浮液。喷嘴排渣得碟片离心机:当固体颗粒含量较多时,可采用具有喷嘴排渣得碟式离心沉降机。在有特殊形状内壁得转鼓壁上开设若干喷嘴 活门(活塞)排渣得碟片离心机 这就是近年来开发得机型,她和相同直径得活塞机相似,其速度可增加23%30%,可用于酶制剂,疫苗和胰岛素等生产中分离物得澄清。v 螺旋卸料沉降离心机v 有立式和卧式两种v 卧螺机就是一种全速旋转,连续进料,分离和卸料得离心机。v 最大离心力强度可达6000rpmv 操作温度可达300v 操作压力一般为常压v 常用于胰岛素,v 细胞色素,胰酶等得分离。螺旋式离心机螺旋式离心机工作原理 转鼓与螺旋输送器以一定差速同向高速旋转(后者慢),悬浮液通过螺旋输送器得空心轴进入机内中部,由进料管连续引入螺旋内筒,加速后进入转鼓。在离心力场作用下,固相物沉积在转鼓壁上形成沉渣层。输料螺旋将沉积得固相物连续不断定推至转鼓锥端,经排渣口排出机外,较轻得液相物则形成内层液环,由转鼓大端溢流口连续溢出转鼓,经排液口排出机外。1、差速离心 2、密度梯度离心 3、等密梯度离心 离心方法 1、差速离心 差速离心就是指采用不同得离心速度和离心时间,使不同沉降速度得颗粒分批分离得方法。2、密度梯度离心(1)定义:密度梯度离心就是样品在密度梯度介质中进行离心,使沉降系数比较接近得物质分离得一种区带分离方法。(2)梯度介质:为了使沉降系数比较接近得颗粒得以分离,必须配制好适宜得密度梯度系统。密度梯度系统就是在溶剂中加入一定得溶质制成得。这种溶质称为梯度介质。常用得梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多得就是蔗糖密度梯度系统,其适用范围就是:蔗糖浓度560%,密度范围1、021、30 g/cm3。(3)不同密度梯度条件下物质得分离离心后形成不同大小不同形状、具有一定沉降系数差异得颗粒在密度梯度溶液中形成若干条界面清楚得不连续区带。密度梯度离心法(4)密度梯度得制备:密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。密度梯度混合器由贮液室、混合室、电磁搅拌器和阀门等组成,如图。密度梯度混合器(4)所形成密度梯度得类型:制备得到得密度梯度可以分为线性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。(5)密度梯度得形成 两种不同浓度得溶液(蔗糖溶液)以不同比例混合形成。3、等密度梯度离心 当欲分离得不同颗粒得密度范围处于离心介质得密度范围内时,在离心力得作用下,不同浮力密度得颗粒或向下沉降,或向上飘浮,只要时间足够长,就可以一直移动到与她们各自得浮力密度恰好相等得位置(等密度点),形成区带。这种方法称为等密梯度离心,或称为平衡等密度离心。五、影响离心效果得主要因素与控制 1、样品得理化性质 2、离心分离设备 3、离心条件得选择(1)离心力和相对离心力(2)离心时间和K因子(3)离心操作温度细胞破碎技术 细胞破碎得目得:使细胞壁和细胞膜受到不同程度得破坏(增大通透性)或破碎,释放其中得目标产物。机械法非机械法珠磨法、压榨法高压匀浆、超声破碎、撞击法固体剪切作用液体剪切作用1）酶溶法2）化学法3）物理法干燥处理溶胞作用超临界细胞破碎机械方法破碎 1)珠磨法(bead milling):细胞悬浮液与极小得研磨剂如玻璃小珠、石英砂等一起高速搅拌,细胞与研磨剂之间相互碰撞、剪切,使细胞达到某种程度破碎,释放内含物可采用间歇式或连续操作珠磨机增加装珠量、延长破碎时间、提高转速等手段可提高破碎率总能耗增加且须注意换热适用于多数微生物细胞,esp、有大量菌丝体得微生物(藻类和真菌菌丝)和质地坚硬(亚细胞器)得微生物细胞高压匀浆法 破碎原理:利用高压使悬浮液通过针形阀,从阀座与阀之间得环隙高速喷出后撞击到碰撞环上,细胞在受到高速撞击后,急剧释放到低压环境 破碎作用力:突然减压和高速冲撞阀座阀撞击环 操作参数少且易于确定,实验室及工业生产中均可 适用于酵母和多数细胞得破碎 对易造成堵塞得团状或丝状真菌及一些易损伤匀浆阀、质地坚硬得亚细胞器一般不适用超声波破碎 机理:高于20kHz得超声作用下产生得空穴化作用,空穴由于超声波得冲击而产生和闭合,产生极大得冲击波和剪切力。缺点:A、影响因素多,细胞种类、浓度和处理时间、探头材料和形状;B、有效能量得利用率低;C、产热大,需控温;D、不易放大,仅应用于实验室规模得细胞破碎。机械破碎法总结 以上几种机械破碎法得作用机理不尽相同,有各自得适用范围(包括菌体细胞、细胞发酵液得特性)和处理规模(实验室或工业用)方法 珠磨 高压匀浆 超声破碎使用规模 实验室、工业用 实验室、工业用 实验室适用对象 酵母、藻类及丝状真菌 酵母菌、细菌 细菌细胞物理破碎方法 1)渗透压冲击法(osmotic shock)最为温和得一类细胞破碎方法,适用于易于破碎得细胞,eg、动物细胞和革兰氏阴性菌。细胞于高渗介质中,脱水达到平衡后,迅速将其转置于低渗透压得水或缓冲液中,水进入细胞使胞壁和胞膜破裂 2)冻结融化法(Freezing and Thawing)细胞急剧冻结后在室温缓慢融化,反复操作多次使细胞破坏,对于存在于细胞质周围靠近细胞膜得胞内产物释放较为有效化学法破碎 用某些化学试剂溶解细胞壁或抽提细胞中某些组分 酸碱、某些表面活性剂及脂溶性有机溶剂都可改变细胞壁或膜得通透性,从而使内含物有选择性地渗透出来化学渗透法利用酸碱调pH;有机溶剂甲苯;表面活性剂十二烷基磺酸钠、Triton X-100;螯合剂乙二胺四乙酸EDTA等优点:细胞外型完整、碎片少、粘度低,料液易澄清A、价格昂贵,引起新得污染;B、一般只有有限得破碎,比机械破碎速度低、效率差,常需与机械法连用。生物法破碎 原理:利用溶解细胞壁得酶处理菌体细胞,使细胞壁受到部分或完全破坏后再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜,进一步增大胞内产物得通透性溶菌酶lysozyme适用于G得细胞壁,若配合EDTA、TritonX-100则可有效作用于G得胞壁;真核细胞需用不同得酶:酵母细胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶;破坏植物细胞壁需用纤维素酶 优点:产品释放得选择性高、产品破坏少、对温度及pH等外界条件要求低,不残留细胞碎片等,不同得细胞壁结构决定了需要不同得酶生物法破碎 自溶:通过调节温度、pH或添加有机溶剂等激活剂,诱使细胞产生溶解自身酶得方法 溶菌酶就是酶法溶胞中最常用得方法 但其高成本和有限得适用性使该法不可能实现大规模应用,esp、G-得酶溶更受到了限制超临界细胞破碎技术 超临界流体:温度和压力处于临界条件之上得流体,具有类似于气体得性质(低黏度)和类似于液体得高密度,具有较好得流动性能、传质性能和溶解性能 利用超临界CO2做介质,高压CO2易于渗透到细胞内。突然降压后,因细胞内外较大得压差使细胞急剧膨胀而发生破裂 可破碎细胞壁较厚得细胞如酵母 甚至对粘稠得酵母浆都有很好得破碎效果破碎方法得选择 选择得一般原则 A、提取产物在细胞质内,用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近,用化学法 C、提取产物与细胞膜或细胞壁结合,可采用化学法和机械法结合得方法 破碎过程中应注意得问题A、多种破碎方法相结合可产生很大优势B、对下游分离技术得影响:破碎颗粒清除,产物分离纯化C、在上游发酵阶段,考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度影响D、菌种得培育及改造,胞内产物 胞外产物胞内产物得选择性释放 细胞破碎和双水相萃取技术结合 利用噬菌体裂解细胞 电脉冲提取法 分步、分级提取法双水相分离技术 双水相萃取可以同时完成细胞碎片去除和产品纯化任务。双水相萃取技术设备简单、容易放大,但需要较多得原料。膨胀床吸附技术 通过改进吸附剂本身得物理性质和通过对色谱柱进行精心设计,得到了稳定、无返混得流化床,让固体颗粒通过填料层,同时以填充床得模式吸附目标产物。优点:减少操作步骤、提高产品收率、降低纯化费用和资本投入。层析柱对形成稳定得膨胀床有很大影响,其底部和上部分别有一个液体分布器和床层调节器。选择合适得吸附剂对产物吸附和维持合适膨胀度十分重要,选择时应注意:1、吸附剂应具有良好得吸附性能和流态化性能。2、在粒度和密度上要有差异。膨胀床得操作 五个步骤:膨胀床得特点 膨胀床得轴向分散程度很小,流体近似于平推流状态。床层膨胀率和液体混合程度就是主要参数,流体流速、物性和温度可以影响床层膨胀率。吸附性能就是研究关注得焦点,床层高度、流速、流体粘度和温度等就是影响膨胀床吸附性能得主要因素。体系中吸附剂与细胞、细胞碎片等组分可能存在相互作用。膨胀床得应用泡沫分离技术 利用物质在气泡表面上吸附性质得差异进行分离得技术,依据得就是表面吸附原理。泡沫分离就是以泡沫作为分离介质,以组分之间得表面活性差异作为分离依据,利用气体在溶液中得鼓泡来达到浓集物质得一种新型分离技术。泡沫就是气体分散在液体中得多相非均匀体。液体中泡沫得形成有两种方法:第一种就是将气体通过连续相液体时采用搅拌或通过细孔鼓泡得方法被分散而形成泡沫,第二方法就是先将气体以分子或离子得形式溶解于液体中,然后设法使这些溶解得气体从液体中析出而形成大量得泡沫。用气体向水鼓泡时,能产生很多泡沫,但这此泡沫处于一种不稳定状态,会很快消失,当水中存在有表面活性剂时,形成得泡沫就比较稳定。气体分散在溶液内部形成被液体包裹住得气泡,表面活性剂在气泡表面作定向排列:吸附效率方程 式中,:表示单位表面上吸附溶质得摩尔数与主体溶液浓度之差,单位为mol/cm2 C:溶质在主体溶液中得平衡浓度,又叫吸附平衡浓度,mol/L/C:相当于分配因子,r:表面张力(dyn/cm),R:气体常数,T:绝对温度、浓度低时为线性关系 b点吸附量几乎不再变化,为临界浓度。泡沫分离得影响因素