分子生物学ppt课件第13讲.ppt

三、基因间抑制突变基因间抑制突变的种类A.基因间无义抑制突变（nonsense suppressor mutation）B.基因间错义抑制突变（missense suppressor mutation）C.基因间移框抑制突变（frameshift suppressor mutation）发生基因间抑制突变的基因A.tRNA基因B.与tRNA功能有关的基因（一）基因间无义抑制突变1，抑制tRNA及其种类（1）抑制tRNA（2）无义抑制tRNA的种类2，琥珀（Amber）型和赭石（Ochre）型抑制tRNA3，Opal抑制tRNA的特殊性4，无义抑制tRNA的产生对正常氨基酸密码子识别的影响5，无义抑制tRNA对翻译的正常终止的影响（1）Amber和Opal抑制tRNA对正常终止影响不大（2）Ochre抑制tRNA的存在对细胞有较强的负选择作用（二）基因间错义抑制突变1，反密码子突变造成的错义抑制（图5-4）2，tRNA结构其他部分的改变，使氨酰基-tRNA合成酶错误识别造成的错义抑制3，反密码子突变，使氨酰基-tRNA合成酶错误识别造成的错义抑制4，氨酰基-tRNA合成酶突变造成的错义抑制（三）基因间移框抑制突变1，tRNA分子结构的改变导致的移框突变抑制（图5-6）2，tRNA分子与两个碱基配对引起的移框突变抑制（图5-6）（四）温度敏感抑制突变和抑制增强突变1，温度敏感抑制突变2，抑制增强突变四、基因间间接抑制突变的作用机制基因间间接抑制突变：凡是能够使某一突变基因产物在一定程度上完成其使命的其他基因突变，突变基因产物妨碍了蛋白质复合体亚基之间的相互作用时，通过改变与突变基因产物相互作用的蛋白质的结构，部分恢复蛋白质复合体的功能，突变基因产物酶活力下降，造成最终产物减少时，通过其他基因的突变增加底物，以提高最终产物的产量，突变基因产物酶活力下降，造成最终产物减少时，通过提高旁路途径，或产生新的生化途径，提高最终产物的产量，突变基因产物酶活力下降，造成待分解产物积累时，通过提高下游途径的效率，或者改变下游途径，降低因突变基因造成的物质积累，调控区的突变效应可通过改变调控蛋白质的活力得到抑制第四节 突变剂和突变生成一、碱基类似物在DNA复制时的渗入1，DNA复制时碱基类似物渗入的结果2，5-溴尿嘧啶（BU）造成的碱基转换3，2-氨基嘌呤（AP）造成的转换二、DNA分子上碱基的化学修饰（一）亚硝酸引起的氧化脱氨反应（图5-12）亚硝酸可使含NH2基的碱基（A、G、C）氧化脱氨，NH2基变为酮基1，腺嘌呤氧化脱氨2，胞嘧啶氧化脱氨3，鸟嘌呤氧化脱氨（二）NH2OH的致突变作用（三）烷基化试剂的致突变作用1，常用的烷基化剂2，烷基化的主要位点3，N-7烷基化鸟嘌呤的效应三、嵌合剂的致突变作用1，丫啶染料分子的特点分子均含丫啶稠环分子大小与DNA碱基类似，可嵌入到DNA的碱基对之间2，嵌合剂的作用其插入可使DNA在复制时插入一个或两个碱基；有时导致低频率的单碱基缺失突变四、转座成分的致突变作用五、增变基因1，增变基因定义：某些基因的突变将造成整个基因组的突变率明显上升，称为这些基因增变基因2，增变基因的分类（1）DNA聚合酶的基因（2）错配修复系统基因dam基因mut基因六、紫外线的致突变作用七、突变热点（一）突变热点的检测（二）突变热点形成的机制1，5-甲基胞嘧（MeC）啶造成的突变热点（1）MeC的形成及脱氨氧化胞嘧啶可被甲基化成为5-甲基胞嘧5-甲基胞嘧可脱氨氧化成为胸腺嘧啶（2）DNA复制的不同时期MeC脱氨氧化的后果新生链中可被修复非复制时期有一半可能发生突变复制时期作为模板链，则将快速导入突变2，短的连续重复序列造成的突变热点短的连续重复序列处容易发生插入或缺失突变3，不同突变剂造成的突变热点不同第五节 离体定向诱变一、寡核苷酸引物诱变（一）定点突变基因的克隆过程1，正链DNA的制备 通过基因工程方法，构建含待突变的基因M13重组噬菌体。制备重组M13噬菌体单链DNA2，突变引物的合成合成一条与正链互补的含突变位点的寡核苷酸引物。引物长约15 20个碱基，突变位点位于中间3，异源双链DNA分子的制备在较低温度下将引物与正链杂交在DNA聚合酶I的Klenow片断作用下，引物以正链为模板延伸，直至合成出全长的互补链4，转化宿主用DNA连接酶切刻连接，将此双链DNA导入大肠杆菌5，突变体的筛选根据具体情况，采用适当方法筛选，包括：（1）限制位点筛选法若定点突变导致了一个限制性内切酶的引入或消失，则可通过该限制酶酶切筛选突变体（2）杂交筛选法原理：类似于菌落杂交探针：放射性32P标记的含突变位点的寡聚核苷酸。探针能与突变体完全配对杂交温度：选择探针能与突变体杂交而不能与野生性分子杂交的温度（3）生物学筛选法若定点突变能够产生明显的生物学表型特征，就可以使用生物学筛选法。6，突变基因的鉴定通过DNA序列分析对突变基因进行鉴定（二）提高寡核苷酸引物诱变效率的方法异源双链DNA分子是由一条突变体链和一条非突变体链组成的，当其在细胞内复制之后必定会产生出突变体和非突变体两种子代分子。提高寡核苷酸引物诱变效率的策略：去除异源双链中的非突变链，抑制非突变体的生长1，Kunkel定点诱变法脱氧尿苷三磷酸酶缺陷（dut-）和尿嘧啶-N-糖基酶缺陷（ung-）大肠杆菌的特点：可以合成掺U的DNA分子（1）通过转化dut-ung-双缺陷大肠杆菌获得掺U的M13噬菌体DNA（2）在异源双链DNA分子的制备过程中，将形成一条链含U（未突变链）而另一条链不含U（突变链）的双链DNA（3）将异源双链DNA分子导入ung+宿主中，含U的噬菌体将不能复制2，硫代磷酸诱变法一些核酸内切限制酶无法切割硫代磷酸DNA分子（1）在异源双链DNA分子的制备过程中加入硫代磷酸，使新合成的含突变位点的DNA链硫代磷酸化（2）用相应的核酸内切限制酶切割异源双链后，再由外切核酸酶局部消化（3）重新进行DNA聚合反应，产生出具有定点突变的双链DNA分子二、PCR诱变法大引物诱变法（megaprimer method of mutagenesis）1，第一轮PCR引物：突变引物/短侧翼引物退火温度：低2，第二轮PCR引物：长侧翼引物/第一轮PCR的产物（大引物）退火温度：高3，将PCR扩增产物连接到载体分子上三、盒式诱变原理：当靶DNA序列两侧存在两个限制性酶切位点时，两者之间的DNA序列就可以被酶切去除，并由一段人工合成的具有突变位点的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列第五章 原核生物基因表达的调控第一节 概述一、原核生物的特点1，结构简单2，生长与环境关系密切3，具有高度的适应性和应变能力生物大分子的合成、终止、及降解迅速，并受到严格的调控二、原核生物基因表达的调控方式1，DNA水平的调控基因重排2，转录水平的调控操纵元系统时序调控以翻译方式调控3，翻译水平的调控mRNA的二级结构对表达的调控反义RNA的作用mRNA的稳定性对翻译的影响第二节 正控制和负控制一、正控制（positive control）系统和负控制（negative control）系统（一）负控制系统1，负控制系统定义在没有调节蛋白质存在时基因是表达的，加入调节蛋白质后基因表达活性被活性被关闭。关闭。这样的这样的调控系调控系统称为统称为负负控制控制系统系统2，阻遏蛋白（repressor）负控制系统中的调节蛋白质（二）正控制系统1，正控制系统定义在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入调节蛋白质后基因表达活性被开启。这样的控制系统称为正控制系统2，激活物（activator）正控制系统中的调节蛋白质