皮肤组织病理切片技术课件.ppt

皮肤组织病理切片技术 一、取材1、手术取材。适用于：（1）面部、关节部，易出血部位等；（2）较大、较深的皮疹；（3）结节和囊肿性皮疹；（4）切除治疗和检查，主要用于小的肿瘤。2、钻孔取材。（角膜钻孔器）适用于一般的皮疹取材。二、固定 固定的作用和目的：1、可以防止组织溶解及腐败。2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分沉淀保存下来，保持它原有的结构与生活时相仿。3、因沉淀及凝固的关系使细胞内成分产生不同的折射率，造成光学上的差异，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起来了，并使得细胞各部分容易染色。4、固定剂兼有硬化作用，使组织硬化，增加组织硬度，使组织不易变形，在制片过程中，可减少继续收缩。因此，固定是制片过程中的一个重要程序。固定的注意事项：1、组织块必须小而薄。2、固定液对组织有收缩及硬化作用，亦有使组织膨胀的作用。3、组织固定，注意掌握时间。4、组织干涸后再作固定，细胞因而收缩过甚，细胞挤成长条，造成人为变态，失去病理诊断价值。常用固定液 甲醛 俗称福尔马林，久存则氧化产生甲酸，呈酸性，酸性的甲醛使标本嗜染酸性，严重时可影响细胞核的嗜碱性染色，故最好用中性福尔马林。组织固定和标本保存常用10%福尔马林液。配法：(PH 7.07.2)甲醛 100ml NaH2PO42H2O 5.2g 或 无水 4.0g Na2HPO412H2O 16.4g 或 无水 6.5g 蒸馏水 900ml 三、脱水 组织脱水，就是把组织内的水分彻底除掉，故亦称无水法。无论任何组织都含有不同程度的水分。一般组织经过固定和水洗进行石蜡包埋，而水与石蜡不能相混合，所以在浸蜡、包埋前，必须将组织内所含的水分脱去。脱水剂必须与水在任何比例均能混合的液体，最常用的脱水剂是酒精。酒精 高浓度酒精对组织有强烈收缩及脆化的缺点。因此，在以酒精作为脱水剂时，应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，即由稀而浓，使逐渐脱掉组织中的水分，这样可避免组织过度的收缩。四、透明 石蜡切片，组织既要脱水，又要经过透明步骤。目的是要使石蜡渗入组织。透明剂不仅有脱酒精的作用，也能溶解石蜡，与石蜡混合能帮助石蜡渗入组织。起到充分支持作用，使其硬度均匀，切片完整。二甲苯、苯、甲苯 三者都是挥发性无色透明液，能溶于酒精，亦能溶解石蜡，为良好透明剂，尤以二甲苯为常用。组织脱水后，直接投入透明剂，能使组织透明，又可使组织收缩和硬化，故透明时间不宜过长。二甲苯常为30分钟至2小时。五、浸蜡 浸蜡是将石蜡渗入组织中，充分填充，使其硬度均匀，切片完整。组织块首要彻底脱水，才能充分透明；组织愈透明，则石蜡渗透愈速，就更利于切片。六、包埋 石蜡包埋主要将组织饱浸于石蜡中，通常浸蜡和包埋蜡加12%蜂蜡，增加粘性。七、切片 厚度为5m八、染色目的：组织通过固定、脱水、包埋、切片等一系列的过程后，制成切片，如果不经过任何染色，在显微镜下只能看到极其简单的组织结构和轮廓，远远不能满足诊断的要求。用染色的方法显示切片的组织和细胞的形态结构，通过组织和细胞的形态变化来研究其变化的发生和发展。染料的性质和类别：染料是一类有色的有机化合物，不但要有鲜艳的色彩，而且对于纤维或组织必须具有亲和力。按染料来源分为：1、天然染料；主要有苏木素、胭脂红等。2、人工染料；主要有苦味酸、甲苯胺蓝、伊红Y、等。按染料用途分为：1、细胞核染料；常为碱性，如苏木素、结晶紫、甲苯胺蓝等。2、细胞浆染料：常为酸性，如伊红Y、苦味酸、酸性品、红等。3、脂肪染料：如苏丹黑、油红O等。九、封固 中性树胶作封固剂，将中性树胶滴于切片上，并用盖玻片盖在切片面。封固后平置于干燥、阴凉处，以便久存。石蜡制片程序：取材 固定 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 染色 封固皮肤标本常规石蜡制片过程：固定 10%中性福尔马林 4小时以上脱水 80%酒精 4小时 95%酒精 I 4小时 95%酒精 II 过夜 或 5小时 100%酒精 I 1小时 100%酒精II 1小时透明 二甲苯 45分钟1小时 浸蜡 34小时 包埋切片 5微米染色 切 片 质 量 标 准（100分）切片完整 10分 没有刀痕 5分 厚薄均匀 10分（一层细胞）附贴适量 5分 平坦无褶 10分 树胶适量 5分染色鲜艳 10分对比清晰 10分透明度好 10分片内无污染 10分无“人工”现象 5分玻片整洁 5分标签端正 5分常 规 染 色H E染色（苏木素伊红染色法）染色方法：二甲苯 I 20分钟 二甲苯 II 20分钟 95%酒精 二浸次 95%酒精 二浸次 80%酒精 二浸次 水洗 苏木素 1015分钟 水洗 1%盐酸酒精 12分钟 水洗后浸 15分钟 伊红 30秒1分钟 水洗 一浸次 80%酒精 一浸次 95%酒精 I 一浸次 95%酒精 II 一浸次 100%酒精 I 一浸次 100%酒精II 一浸次 二甲苯 I 一浸次 二甲苯 II 一浸次 中性树胶封固 Ehrlich氏苏木素 苏木素 2 g 无水酒精 100 ml 甘 油 100 ml 冰醋酸 10 ml 蒸馏水 100 ml 硫酸铝钾 23 g 一般医院病理科用Harris苏木素染细胞核。Harris苏木素因含有氧化汞，配制时，加热沸腾时容易喷出，危险期大，而Ehrlich苏木素安全性好；Ehrlich苏木素呈兰褐色，色彩鲜艳，染料使用时间长，可达3 4个月，染色稳定。盐酸酒精分化时，Harris苏木素分化短，数十秒1分钟，略长时染色淡；而Ehrlich苏木素分化时间可长可短，间隔可达1 5分钟，不影响染色结果。结果：细胞核呈蓝色，细胞浆及其他组织呈红色。特 殊 染 色 组织切片经HE染色法染色，其基本形态、组织变化及组织产物都可显示出来。而组织中有些特殊结构，如胶元纤维、弹力纤维、糖、脂肪、真菌孢子、神经等，在HE染色下不能明显区别，需通过不同的特殊染色方法，显示其特有的结构和色彩加以区别，特殊染色对病理诊断有极其重要的意义。现介绍皮肤组织常用的几种特殊染色方法：一、V G法（胶元纤维染色法）结缔组织含有三种纤维，即胶原纤维、网状纤维、弹力纤维。胶原纤维在结缔组织中含量最多，起支持作用，具有一定的韧性和坚固性，抗拉力强的特点。胶原纤维染色在病理诊断上主要用于和肌纤维的鉴别。常用的胶原纤维染色方法为VG法。结果：细胞核蓝黑色或黑色，胶原纤维红色，肌纤维、细胞浆、红血球呈黄色。二、弹力纤维染色 弹力纤维具有弹性，可以伸达原长的一倍半。弹力纤维比胶原纤维细，纤维分支，交织成网。弹力纤维由集合成束的弹力微原纤维和均质状的弹力蛋白组成，能抵抗沸水、弱酸及碱的溶解，但可被胃液、胰液消化。在HE染色中，弹力纤维和胶原纤维相似，都着染红色，二者较难区别，若用特殊染色方法可区别二者，常用的弹力纤维法有间苯二酚、地衣红法等。间苯二酚法结果：弹力纤维呈深蓝黑色，胶原纤维呈红色 肌纤维和红细胞呈黄色。三、PAS染色法：亚硫酸氢钠遇盐酸产生亚硫酸气体，盐基品红在亚硫酸气体的作用下变为无色品红。高碘酸是一种氧化剂，它能破坏多糖类结构的碳键，使多糖分子的乙二醇或氨羟基的碳键打开，生成醛类化合物，游离的醛基与无色品红作用生成新的红色复合物，称为雪夫氏（Schiff）反应。结果：基底膜、真菌、Paget细胞呈红色，细胞核呈蓝色。四、Giemsa染色、甲苯胺蓝法：在皮肤病病理诊断中，常用此二法染肥大细胞，肥大细胞呈园形、卵园形或长形，细胞浆内含有嗜碱性粗颗粒，若用Giemsa及甲苯胺蓝染色，则颗粒具有异染性而呈紫红色，不呈蓝色。五、结晶紫染色 淀粉样蛋白成分为90%淀粉样原纤维蛋白，10%糖蛋白。对结晶紫有异染性呈紫红色。六、阿尔新兰(alcian blue)染色法 阿尔新兰是一类铜酞花青染料，易溶于水，因含铜而呈蓝色，阿尔新兰与组织内含有阴离子基团，如酸性粘多糖的羧基形成不溶性的复合物。即染料中带正电荷的盐键与酸性粘液中带负电荷的酸性基团结合呈蓝色，其结合与PH值有关，常采用PH2.5或PH1.0。七、抗酸染色 抗酸杆菌属分枝杆菌，由于菌体壁上含有类脂，一般不易着色，但一经着染后可抵抗酸的脱色作用，故称抗酸染色。常见的抗酸杆菌为结核杆菌和麻风杆菌。八、含铁血黄素染色法 含铁血黄素是一种血红蛋白源性色素，为金黄色或黄棕色，由氢氧化铁和铁蛋白组织的复合物。由于铁蛋白的分子含有高铁盐，用亚铁氰化钾和盐酸处理后产生蓝色，呈普鲁士蓝反应。谢 谢