基因工程抗体ppt课件.pptx
基因工程抗体Emil von Behring,1901,antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein,1984,monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987,structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter,1972,structure of antibodyPaul Ehrlich,1908,production of antibodyNobel Prize winners免疫球蛋白的功能5美国FDA已批准的治疗抗体药物OrthocloneReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinMylotargCampath-1HZevalin移植排斥心绞痛B细胞非霍奇金淋巴瘤移植排斥移植排斥婴儿呼吸道合胞病毒类风湿关节炎乳腺癌急性复发性髓性白血病难治性慢性淋巴细胞白血病难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤19861994199719971998199819981998200020012002一 抗体分子结构免疫球蛋白的功能区免疫球蛋白的水解片段complimentarity determining region,CDRhypervarible region(HVR)(complimentarity determining region,CDR):formation of the Ag binding sitepurple:HV CDR(in both the ribbon and ball and stick views)green:antigen HV sequences contact the antigen.antibodyantigenantigen-antibody complex:epitope13Ig胚系基因结构特点在Ig分子多肽链中，型、型轻链和Ig的重链分别写作Ig、Ig和IgH，基因依次写作IGK、IGL和IGH，其分别位于第2、22和14号染色体上。14重链:位于14号染色体，可分为4组CV区编码基因:VH(可变区)-48 DH(多样性区)-23 JH(连接区)-6C区编码基因:CH(恒定区):C,C,C等10个片段15轻链(-2号染色体,-22染色体)V区编码基因:-V,J-40,5-V,J-30,4C区编码基因:C(1);C(4)二、细胞工程抗体和基因工程抗体第一代：多克隆抗血清第二代：细胞工程抗体第三代：基因工程抗体抗体技术的发展经历了三个阶段 1890年Behring和北里柴三郎等人发现白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。1937年Tiselius等人用电泳法将血清分为白蛋白、甲种（）球蛋白、乙种（）球蛋白、丙种（）球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年Khler and Milstein等首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)。1994年基因工程抗体。1、多克隆抗体(polyclonal antibody;PcAb)多价抗原多个克隆（致敏的B细胞）多克隆抗体 实际意义（1）预防、治疗感染性疾病，如：破伤风抗毒素血清 抗破伤风，胎盘球蛋白 抗病毒感染等，副作用：超敏反应。（2）临床诊断，如：肥达氏反应-伤寒、副伤寒，缺点：特异性差。2、单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。特点：具有高度均一性。杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞-无限增殖；免疫B细胞-合成、分泌特异性抗体。杂交瘤技术-HAT培养基：次黄嘌呤(H),氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。单抗制备的流程图 实际意义：（1）抗原的纯化和结构分析；（2）细胞发生、分化及功能的阐明；（3）临床疾病的诊断和治疗，如：免疫分子检测；免疫导向药物治疗恶性肿瘤-McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。多克隆抗体 单克隆抗体来源 动物免疫血清、恢复期病人血清或免疫接种人群多为鼠源性特点 来源广泛、制备容易 纯度高、特异性强、效价高、少或无血清交叉反应组成 针对不同抗原表位的抗体的混合物针对单一表位，结构和组成高度均一，抗原特异性及同种型一致应用 疾病的被动免疫治疗 疾病诊断、特异性抗原或蛋白的检测和鉴定、疾病的被动免疫治疗和生物导向药物制备缺点 特异性不高、易发生交叉反应，不易大量制备人体应用后可导致人鼠抗体反应多克隆抗体与单克隆抗体的比较单抗体内应用和疗效受限原因：1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量甚少3.生产成本高,难于普及应用人杂交瘤技术未获真正突破原因:融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不能随意免疫新思路：尽量减少抗体中的鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。基因工程抗体：根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体，主要包括嵌合抗体、人源化抗体、小分子抗体、抗体融合蛋白和双特异性抗体。27基因工程抗体1 小分子抗体3 鼠单抗人源化基因工程改造的抗体2 第一代的抗体人源化嵌合抗体 从杂交瘤细胞分离出鼠鼠MAbMAb功能性可变区基因，与人Ig恒定区（决定免疫原性）基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。嵌嵌合合抗抗体体由由于于这这两两部部分分在在空空间间结结构构上上相相对对独独立立，其其独独特特的的抗抗体体亲亲和和力力保保持持得得很很好好，但但因因鼠鼠单单抗抗可可变变区区的的存存在在，应应用用时时仍仍有有较较强强的的免免疫疫排排斥斥反反应。应。特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL免疫球蛋白基因载体的构建H链嵌合载体L 链嵌合载体共转染细胞启动子人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略 鼠VH 鼠V L人CL人CH抗体分泌细胞人-鼠嵌合基因工程抗体第二代的抗体人源化改型抗体 在在嵌嵌合合抗抗体体的的基基础础上上进进一一步步将将鼠鼠MAbMAb可可变变区区中中相相对对保保守守的的FR(framework FR(framework region)region)替替换换成成人人的的FRFR，保保留留与与抗抗原原结结合合部部位位决定簇互补 区（complement complement determinant determinant region)region)部位部位(即即CDRCDR移植移植)早期的改型抗体：早期的改型抗体：简单的简单的CDRCDR移植，通过点突变进行移植，通过点突变进行微调即更换某个位点上的氨基酸。微调即更换某个位点上的氨基酸。CDR序列 CDR序列 鼠单克隆抗体 人抗体人源化抗体鼠单克隆V区人源化（CDR移植）小分子抗体 人源化抗体属完全的抗体分子。通过基因重组技术，可以在保持原有抗原结合活性的基础上，把完整的抗体分子改造成较小的分子，称为小分子抗体。根据其价数的不同可分为单价小分子抗体及多价小分子抗体。单价小分子抗体一、Fab抗体FabFab段由重链段由重链VV区及区及CH1CH1功能区与整个轻链以二硫功能区与整个轻链以二硫键形式连接而成，主要发键形式连接而成，主要发挥抗体的抗原结合功能。挥抗体的抗原结合功能。FabFab抗体只有完整抗体只有完整IgGIgG的的1/31/3。二、单链抗体(ScFv)定义：用基因工程方法，将抗体VH和VL（重链和轻链可变区）通过一个连接肽连接而成的小分子抗体，功能：具有较好的抗原结合能力，且分子量小、穿透力强、免疫原性低等特性。可与其他效应分子构建成多种具有新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体等的理想而基本的元件。Ag ScFv应用：用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 研究基因结构与功能的关系小分子抗体123免疫球蛋白基因载体的构建H链表达载体 L链表达载体共转染细胞Pr VH CH1 Pr VL CLFab 抗体分子的制备I Fab antibody molecule抗体分泌细胞VH VLCL-S-S-CH1Fab 抗体分子的制备II Fv antibody molecule分别构建载体L链表达载体H链表达载体共转染细胞Pr VH Pr VL Fv 二硫键稳定的Fv(disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备(1)ds-Fv抗体分泌细胞VH VL-S-S-Fv小分子抗体的制备disulfide-stabilized Fv,ds-Fv三、单域抗体 抗体与抗原的结合主要由Ig的V区决定，因此只含V区基因片段的小分子抗体，即只有VH或 VL一个功能结构域，也能保持原单克隆抗体的特异性。这种小分子的抗体片段就称为单域或单区抗体，其分子量仅为整个Ig分子的112，故也称之为小抗体。四.超变区多肽 抗体抗原结合是经过补体决定区（CDR）来实现。因此，CDR是构成抗原抗体结合的最小结构单位。根据这一特点，可以设计出那些在抗原识别及亲和力方面有重要意义的CDR多肽，直接用于诊断或治疗，可望获得理想的结果。这种只含有一个CDR多肽的抗体，称为超变区多肽，亦称为最小识别单位(minimal recognition unit,MRU)。提高抗体效应功能抗体融合蛋白 双特异性抗体偶连细胞毒物质细胞内抗体提高抗体效应功能双特异性抗体 抗原A抗原B-S-S-FabVHCH1VL-S-S-CH1VH VLFvVH VLCTLCD3TUMORCELL-S-S-VHCH1VL-S-S-CH1抗原A抗原B制备双特异性抗体的方法主要有3种：（1）杂化杂交瘤技术：将具有某种特异性（如抗瘤细胞）的Mab细胞株与具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小鼠脾细胞进行融合，即产生出杂化杂交瘤细胞株的二价瘤体。它们分泌的是重链、轻链被杂化的抗体分子，有10种形式：重链、轻链都无改变，保持原特异性的配对抗体分子：LH-HL，KG-GK 重链特异性相同的配对抗体分子：LH-HK，KH-HK KG-GL，LG-GL 重链、轻链特异性不同的配对抗体分子：LH-GK，LH-GL KH-GL，KH-GK 在这些杂化抗体分子中，只有LH-GK配对的才是所需的双功能抗体分子。（2）化学交联法：Nisonoff和Rivers最早从事这方面的研究。化学交联的方法无需经过细胞融合，所以比较简便易行。通常利用重链与轻链这间的二硫链经还原和再氧化，将两种不同特异性抗体的半分子结合在一起。或用双功能交联剂，如邻苯酸酯等，把两个抗体半分子交联在一起。用于制备双功能抗体的Mab可以是完整分子，也可是经胃酶水解获得F（ab）2片段。后者在减少鼠源免疫原性方面，效果较好。（3）利用基因工程技术将两套重轻链基因导入骨髓瘤细胞或传染瘤细胞中。这种方法制备的双功能抗体可选择合适的稳定区和合适的类及亚类，而得到较好的产量较高的双功能抗体。由于只有较少的嵌合导入并整合到宿主基因组，故传染瘤细胞更为稳定，染色体不易丢失 抗体融合蛋白：抗体的一部分被非抗体序列替代，：抗体的一部分被非抗体序列替代，所形成的具有新的特性融合蛋白。所形成的具有新的特性融合蛋白。根据构建方式的不同，主要分为两种形式：根据构建方式的不同，主要分为两种形式：FcFc融融合合蛋蛋白白（Fc Fc fusion fusion protein,FcFPprotein,FcFP）由由抗抗体体的的Fc Fc 段段与与某某些些具具有有特特定定功功能能的的蛋蛋白白结结构构域域融融合合而而成成。如如CD4CD4免免疫疫粘粘附附素素，就就是是由由抗抗体体的的FcFc段段与与22个个CD4CD4分子的分子的IgIg同源区重组而成同源区重组而成抗抗原原结结合合融融合合蛋蛋白白（antigen-Binding antigen-Binding fusion fusion protein,protein,ABFPABFP）由由具具有有抗抗原原结结合合功功能能的的抗抗体体结结构构与与其其他他功功能能性性蛋蛋白白融融合合构构成成。如如免免疫疫毒毒素素，抗抗体体部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。部分主要包括嵌合抗体、单链抗体形式。免疫粘附素(immunoadhension)：将将人人抗抗体体恒恒定定区区(主主要要是是FcFc段段)N-)N-端端连连接接于于人人细细胞胞表表面面的的受受体体分分子子或或细细胞胞粘粘附附分分子子上上，在在真真核核细细胞胞中中表表达达出出正正确确折折叠叠的的融融合合抗抗体体蛋蛋白白分分子子，这这种种分分子子可可同同时时发发挥挥抗抗体体的的效效应应功功能能及及其其它它相相应应的的效效应应功功能能，这这种种分分子子又又被称为新效能抗体。被称为新效能抗体。免疫毒素：又又称称生生物物导导弹弹，是是由由导导向向性性的的载载体体分分子子与与具具有有毒毒性性的的弹弹头头蛋蛋白白交交联联而而制制成成，属属于于导导向向药药物的一种。物的一种。免疫毒素C CVCVCC C SPDPSPDPRicin ARicin A（-FcRI-Ricin A）Ricin A:蓖麻毒素A,对肿瘤细胞具有毒性作用偶连细胞毒物质连接放射性同位素(131I、99mTc）连接植物或细菌毒素（ricin、PE40）连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）CH1CH2CH3IL-2scFvIL-2 免疫细胞因子(Immunocytokine)复习题简述真核表达载体的种类及特点。哺乳动物的常用标记有哪些？其原理是什么？哺乳动物表达载体有哪几类？各有何优缺点？常用的核酸探针有哪几类？各有何特点？核酸列举常用的探针标记物及标记方法。简述核酸分子杂交的过程及种类。简述人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略简述制备双特异性抗体的主要方法及其特点
