啤酒工厂酵母管理课件.pptx

啤酒工厂酵母管理 李永仙 顾国贤江南大学生物工程学院一.啤酒酵母的扩大培养v 啤酒工厂是一个从啤酒酵母开始，发酵时将需要接入151018个细胞，酵母的扩大培养是否正确合理将深刻影响发酵、影响啤酒风味。严格的无菌操作、适宜的培养基、合理的扩大比、正确的通风量和移种时间是扩培的关键。1、培养基&优良的麦汁是酵母适宜的培养基。&目前很多工厂扩培麦汁（实验室和大生产）直接采自大生产的麦汁，而生产啤酒经常是过高的辅料比，过低的麦汁浓度和氨基氮，贫乏的营养状态培养不出健壮、优良的酵母&在实验室阶段的扩培，要求选择优良的麦芽，低辅料比（1520%），在实验室制备。较长时间的糖化，麦汁浓度控制在11oP，低苦味值（约12），并且在麦汁煮沸时添加鸡蛋清澄清麦汁，培养器皿干热灭菌后，麦汁采用温和的条件进行消毒（如：0.04MPa，20min）。严禁在消毒时形成过多焦糖和类黑色素等有害物质。&作为大生产的扩培麦汁，也应专门为酵母扩培制造一锅特殊的啤酒麦汁，辅料比不宜超过25%，麦汁氨基氮高（如200mg/L麦汁以上），麦汁浓度为11oP（特别对于一级、二级扩培）。v2、大生产麦汁杀菌&我国很多啤酒厂汉生罐麦汁杀菌采用0.1MPa，30min，这样的杀菌条件过于强烈，再因为汉生罐一般没有搅拌器，麦汁在罐内加热升温和降温均采用汉生罐的夹套进行，罐内麦汁对流慢、传热慢、时间过长（68h），杀菌后麦汁颜色过深，并形成大量焦糖和类黑色素等对酵母有毒的物质，营养成分（如氨基酸、维生素等）也损失过多。&实际上我们并不追求麦汁绝对无菌，只求对啤酒有害的微生物如野生酵母、大肠菌群、变性黄杆菌、乳酸菌等全部死灭，而对某些耗氧微生物和孢子，由于不在啤酒发酵中繁殖，他们的存在与否不会对啤酒发酵和风味造成损害。所以大生产扩培麦汁只要求消毒，条件可温和得多。&国外很多啤酒厂大生产麦汁，直接采用经回旋沉淀槽沉淀后的热麦汁输送至酵母扩培间二级种子罐，适当补充营养物质（如添加酵母营养盐），用外置薄板加热至100，保持20min，再用外置薄板冷却至汉生罐培养温度，泵入汉生罐。作为汉生罐培养麦汁，不用再消毒。留下的作二级扩培麦汁，这样麦汁既能保证无菌，又能保证麦汁营养和少产生多酵母有毒害的物质。3、扩大比&在逐级扩大培养中，正确选择扩大比，会影响到起始细胞浓度、扩大培养时间、酵母菌龄一致性以及在扩大培养中抵抗杂菌污染的能力。扩大比遵循的原则如下：在汉生罐以前各级，由于采用较高培养温度（2527），酵母倍增时间短，无菌操作条件好，可采用比10 20；反之，汉生罐以后各级，采用低温培养（不大于13），酵母倍增时间长，杂菌污染机会多，扩大比宜小，一般1 45。&例如：大罐发酵，每罐麦汁量为100m3，若希望发酵接种后细胞培养后浓度为1520 106/ml，则汉生罐以后各级扩大比若定为1 5，可按如下安排，设每一级细胞培养浓度为75 106个/ml。则最末一级（N）罐有效容积为大罐容积：&Vn=(18.75 106/75 106)100m3=25m3 n-1：25 m3/5=5m3n-2：5m3/5=1m3n-3：1m3/5=0.2m3(即定为汉生罐容积)&目前在一些啤酒生产厂家中，酵母扩大培养增殖级数太少，常常采用培养过程中追加麦汁（分次追加法）来补救，例如上例缺少5m3一级，直接从1 m3至25m3级。可用先加5m3麦汁培养24h，再补6m3麦汁培养812h，再补13m3麦汁培养68h，但这种方法仅仅是一种无奈之举。这样的结果使一级酵母将长时间处于低颉氨酸麦汁中，形成较多的双乙酰前驱物质（-乙酰乳酸），同时由此培养出的种酵母，菌龄差异大，大小不整齐，均会影响到第一次发酵。4、培养条件（1）温度 卡尔酵母最适生长温度是31.634,，实际生产的扩大培养过程中，还需考虑到减少酵母的死亡率、减少染菌的可能及让酵母逐步发酵温度。因此，酵母扩大培养采用逐级降低温度的方法。&例如，对于国内的青岛酵母，扩大培养过程中的温度变化为：液体试管(28)小锥型瓶(25)大锥 型 瓶(23)卡 氏 罐(20)汉 生 罐(1315)）一级繁殖罐(1213)二级繁殖罐(1112)发酵(10)&不同的菌株有不同的温度适应性，培养温度的确定应参照其最佳的发酵温度。（2）、通风：啤酒酵母可以在好气或厌氧条件下繁殖，但效果不同。酵母菌进行有氧呼吸1mol麦芽糖时可以获得较多合成细胞用的能量（38个ATP），每消耗1g糖能得到0.5g酵母干物质；在进行无氧发酵时，每消耗1g糖仅能得到0.0278g酵母干物质，而且会积累较多抑制繁殖的酒精，当麦汁中某种氨基酸缺乏时，氨基酸转换困难，细胞合成就受到阻遏。在扩培过程中，氧是非常重要的“营养物质”。v 实际生产中，溶氧控制水平及措施：实验室培养阶段：容器装液量不超过1/2，留有孔穴，有氧气；使用棉塞，提供氧进入途径；灭菌后，培养基放置23d，使麦汁吸氧；接种后48h振荡一次，排出CO2，吸入O2。汉生罐：溶氧水平6.0mg/L培养4h后，每个12h，通风10min；培养到24h后，每隔34h，通风5min。繁殖罐：溶氧水平一级繁殖罐45mg/L，二级繁殖罐34mg/L培养6h，每隔6h通风1015min；20h后，每隔6h通风10min。二、啤酒酵母的接种下面啤酒发酵中，由理论和经验可以概括为：&每1度麦汁发酵需接种密度为1106个/mL，但不低于8106个/mL；&每1度麦汁主发酵最高温度为1，但不低于8；&每1度麦汁发酵麦汁溶氧水平为1mg/L，但不低于8mg/L；酵母在发酵中增殖遵循：M=Z02n式中：M-发酵中酵母最高密度；Z0接种活细胞密度；n增殖级数。&理论上认为，为了控制发酵代谢副产物（如高级醇和醛类）不产生过多，应控制n3。&发酵中酵母最高密度M受酵母品种、培养基营养状态、发酵温度和溶氧水平和接种量的制约。对国内多数啤酒厂家使用的酵母，在11P麦汁，在1011P发酵时，一般最高密度可达6065106个/mL，若 要 n小 于 3，如 n=2.5，则 65106ZO22.5，ZO=11.5106个/mL。&接种量过低，酵母增值慢，起酵慢、增殖级数大，发酵中产生的高级醇会增多。接种量过高，起酵快，降糖快，酵母易衰老，后酵时酵母死亡率增加，酵母自溶分泌高碳链脂肪酸会增加，啤酒易老化。&大罐接种量的一致性是保证发酵一致性、风味一致性的基础，现代啤酒发酵大罐均很大（100600M3），而使用的啤酒酵母有一定的凝聚性。如何保证接种后大罐内酵母分布均匀，这是保证大罐内上、中、下各部发酵均匀一致、少产生有害物质的基础。大罐接种必须把麦汁、空气、酵母正确地定量添加，而且必须把液气固三态乳化成均一的乳化态，一般在泵后通过一台“静态混合器”将三者乳化后进罐。三、种酵母泥的回收、饲养及酸洗 各类酒酿造中，只有啤酒可以用发酵后回收的酵母作为下次发酵的种酵母，在传统发酵种可以使用10代或更多，现代大罐发酵一般也可使用5代。1种酵母回收时间种酵母的会后常常在大罐双乙酰还原结束，发酵液降温至45时回收，发酵曲线见图1所示。图1 常规发酵曲线v 作者曾测定若干啤酒厂回收种酵母代数，它和发酵速率和发酵度无关，而使用代数和酵母泥种杂菌含量（特别时微好氧菌）成级数关系，且和酵母泥种酵母死亡率成政函数关系（见表1）。发酵中污染微生物生长曲线见图2所示。表1 酵母泥种微好氧菌含量（个/107个酵母）酵母使用代数 杂菌数 酵母死亡率（）0 10001 10112.52 10224.03 1034.56.04 1045.06.55 1056.57.5图2 发酵中污染微生物繁殖曲线&大肠菌群等污染微生物在发酵前期麦汁中有氧状态下迅速繁殖，繁殖速度受污染、起始密度和酵母出芽势制约，发酵34天后，溶氧耗尽，发酵液进入还原态，好氧菌开始死亡，在后酵中，虽然好氧菌几乎完全死亡，但其代谢产物早已存在于发酵液中，最后保留在成品酒中。&乳酸菌等微好氧菌，在发酵前期略有减少，在发酵24天后略有增长，当发酵进入双乙酰还原后期，酵母衰老、死亡、自溶后，分泌出肽、氨基酸、维生素等，正好微微好氧菌提供了营养源，微好氧菌迅速繁殖，一般降温前增殖至最高密度，随着降温，酵母絮凝沉淀，微好氧菌被吸附在酵母团中一起沉降应而数量减少。v 如果在45排种酵母，起周围会有较多杂菌和较高酵母菌死亡率。作者主张在主酵结束封罐后，先降低发酵罐锥底温度，再迅速从罐底回收种酵母泥，这样能使种酵母的质量更好。表2 不同时间排种酵母泥的质量种酵母泥代数3代 5代 排酵母时间主酵结束 后酵结束 主酵结束 后酵结束微好氧菌污染率(个/107个酵母)10121023102104酵母死亡率（%）1.52.0 5.06.0 2.02.5 6.08.0酵母肝糖染色率（%）90 80 85 70&主酵结束回收种酵母，在大罐上部和中部，发酵液中悬浮酵母密度并不明显减少，还原双乙酰的速率不会受到影响。v2种酵母的饲养v 现代发酵均有种酵母泥回收罐，一般都在回收罐底注入或泵入酵母泥，这样酵母泥中有较高浓度的二氧化碳度，高浓度的二氧化碳对酵母有毒害，因此回收酵母泥进储罐时建议采用将酵母从储罐顶部喷下的方式，释放二氧化碳，这样更有利于保持种酵母的活性。v 在回收种酵母泥时，虽然罐底温度降至03，但排出酵母泥的温度依旧在8左右，酵母泥稠密，传热困难，因此需要预先在酵母储罐中注入等体积的无菌冰水（01），这样可将注入的酵母泥温度降低到5，并且浓度变得稀薄，再用小剪切力的泵（如齿轮泵），将酵母泥浆从罐内泵出，用薄板外冷却至2以下，进罐饲养。v 酵母在2以下，对外部环境的生理活动趋于停滞，此时酵母慢慢进入生理休眠期，正待出芽的酵母全部转化为营养细胞状态，这样酵母在接种后出芽更均匀。一般在2以下饲养时间为812h，经过休眠后的酵母，接种发酵后会更强壮，出芽更整齐。v 如果休眠时间过长（24h），在接种前需提前23h对酵母储罐进行通风，使酵母复苏，形成芽尖，接种后起酵速率不会降低。3酵母泥的酸洗&目前大生产的技术和控制水平还很难做到发酵液中绝对无杂菌，多数厂家排放3代以后的酵母泥的杂菌大多在102103个，这样的酵母泥如不经过酸洗处理，已不再适合作种酵母，尤其在酿制纯生啤酒时，3代以后的酵母应当废弃。&酵母泥的酸洗处理就是在从酵母回收罐泵出冷却的酵母泥中用定量泵添加稀磷酸（5%），调节酵母泥pH2.83.0，维持2h后立即使用，如果加磷酸时再添加50mg/L的Nisen效果会更好，可杀灭酵母泥中90%的污染细菌。罐内pH会随着存放时间延长而升高，不许进一步调节。四、及时分离发酵罐内沉淀的酵母发酵后以至发酵结束，由于发酵液中营养枯竭，高浓度的二氧化碳和酒精，过高的罐压，过高的温度（单罐酿造时，储酒时罐温达到0，罐中央的温度常常还在56，约需58天才能降到01），沉淀的酵母泥中温度会更高，这些菌能加速酵母的衰老、死亡、自溶，衰老的酵母细胞膜壁渗漏，酵母胞内渗漏物质是啤酒许多异杂味的来源。酵母细胞与啤酒风味的关系见图3所示。1酵母泥的pH值&酵母体内平衡的pH为6.57.0，发酵后期发酵液的pH为4.24.4，如果酵母体内物质渗漏会使酵母外围发酵液pH升高，胞内物质渗漏越多，pH升高越大，采用pH大小可以反映酵母胞壁渗漏程度。pH的测定方法如下：先测啤酒pH1，如=4.2，再取此啤酒的酵母，用6000r/min离心10min后，酵母形成泥状，分离澄清的啤酒，再测此澄清后的啤酒的pH2，则pH=pH2-pH1。&pH在0.10.3，表示正常或接近正常，此酵母泥可以作为种酵母；pH在0.30.5，表示已泄露，但不严重，此酵母泥尚可作种酵母；pH在0.51.0，表示泄露严重，风味改变大，应废弃此酵母。2酵母细胞壁结构：酵母细胞壁外层和中层的甘露聚糖、-葡聚糖很易脱落（大剪切力输送酵母泥也会引起脱落），使酵母泥变得粘稠，进入啤酒会增加啤酒的雾浊，过滤困难。3酵母的吸附：酵母在发酵时会吸收-酸和多酚，在壁膜间积累并氨化和聚合，若氧化-酸和聚酚泄漏进入啤酒，会增加啤酒不愉快后苦味和涩味。4胞内脂肪泄漏会降低啤酒的泡持性。5胞内长链脂肪酸泄漏，氧化后就形成啤酒的老化味。6胞内H2S很容易泄漏，只要啤酒中达到50 ng/L，就会形成酵母臭。7胞内含氮物质常以高肽泄漏，降低啤酒非生物稳定性。8胞内蛋白酶A和肽结合没有活性，在泄漏时肽会脱落，形成活性很强的蛋白酶A，它在啤酒中切割泡沫蛋白，使泡沫活性变差。单罐酿造超长时间贮酒（如大于2月），或纯生啤酒装瓶后超过1个月，啤酒泡持性会变得很差。但在经过热消毒的啤酒，蛋白酶A在58以上就开始钝化，丧失活性。9胞内贮存肝糖（主要是海藻糖）泄漏，会使啤酒碘值不正常，有时可达0.3 0.4，使啤酒非生物稳定性变差。五、总结 总之，成也酵母，败也酵母。因此，不论酿造何类型的啤酒，在双乙酰还原结束后，贮酒期降低酵母死亡、自溶，酒温越底越好，分离酵母泥越彻底越好，这样才能保证酿造啤酒有纯正优良的风味。谢谢大家！