大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计.doc

大肠杆菌基因组DNA得提取一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。1、实验原理提取DNA得一般过程就是将分散好得组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)与蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS得作用机理就是由于其能结合蛋白,中与蛋白得电性,使蛋白质得非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下保持很高得活性。在匀浆后提取DNA得反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)就是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0、7 mol/L NaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度到一定得程度(0、3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB核酸得复合物与蛋白,多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。2、实验试剂与仪器1)实验材料:大肠杆菌2)实验试剂:LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/L NaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇3)实验仪器:恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1)LB液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L,细菌培养用酵母提取物5 g/L,NaCl 10g/L,去离子水。 (搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7、0、用去离子水定容100ml,用20/50ml摇瓶分装5瓶,包扎好,在121,1、034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min、)2)TE缓冲液:1M Tris 溶液(取Tris242、2g,加ddH2O至1600ml,加热溶解)1M trisHCl pH8、0 溶液(取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8、0(需浓盐酸约8、5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用) TE缓冲液(10 mM TrisHCl 1Mm EDTA pH=8、0,1M TrisHCl Buffer PH=8、0 5ml0、5M EDTA PH =8、0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存)3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,20备用)4)CTAB/NaCl溶液:(5% w/v,5gCTAB溶于100ml 0、5M NaCl溶液中,需加热到65使之溶解,然后室温保存) 4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好得LB培养基中,一级培养过夜,以10%得接种量进行二级培养,培养至对数期(46h)。2、取菌液1、5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液3、加190 ul TE悬浮沉淀,并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀,37保温1小时。5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。6、加30ul CTAB/NaCl溶液,混匀,65保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提(25:24:1),5000rmp离心10min8、取上清液,加入300ul氯仿/异戊醇(24:1)抽提,5000rmp离心10min9、取上清液,加入300ul得异丙醇,颠倒混匀,室温下静止10min,沉淀DNA,5000rmp离心10min10、加500ul 70%乙醇洗沉淀,5000rmp离心10min11、弃上清液,待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中,20保存。二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。细菌基因组DNA提取试剂盒:1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP30202 50次 420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa  DV810A 50 650元3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒GD241101 Bacterial gDNA kit 50次 423元GD241102 Bacterial gDNA kit 250次 1798元4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒BSC12S1 50次 400元 BSC12M1 100次 750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D335000 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 5 210元D335001 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 50 980 元D335002 E、Z、N、A、TM Bacterial DNA kit 200 3350元荧光定量PCR试验(标准曲线法)定量实验就是一种实时实验,用于在聚合酶链反应 (PCR) 得每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 (靶)数量。其中靶可以就是 DNA、 cDNA 或 RNA。【实验原理】在实时定量实验中,反应就是在 PCR 产物得扩增达到固定荧光水平时得循环期间时间点来描述得,而不就是在固定循环次数后累积得 PCR 产物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行得循环次数中检测到得荧光。 在 PCR 得最初几次循环中,荧光信号没有明显变化。该预定义得 PCR 循环范围称为基线。首先,软件通过计算归一化报告荧光信号强度 (与基线循环相对应得 Rn 值)得数学趋势,生成一个基线简化扩增曲线。然后,算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 ( delta Rn Rn 值)与阈值交叉得点。 Rn 值与阈值交叉得分数循环定义为 CT。一、试验设计使用StepOne软件中得Design Wizard(设计导向)创建新实验1、定义实验属性在 Experiment Properties (实验属性)屏幕上,输入实验得标识信息,然后选择要设计得实验类型。1)Experiment Name (实验名称)。2)Barcode (条码),然后输入您得 PCR 反应板上得条码。(可不填)3)User Name (用户名)。4)ments (注释)。(可不填)5)选择 Quantitation (定量)实验类型6)Next> (下一步)2、定义方法与材料在 Methods & Materials (方法与材料)屏幕上,选择用于实验得定量方法、试剂、升降温速度与 PCR 模板。1)将 Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。将 Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。 标准曲线实验确定样本中靶序列得绝对量。 从已知量得稀释序列中构建得标准曲线用于归档结果。 当设置反应板时,标准曲线方法需要靶、标准品与样本。用于标准曲线实验得 PCR 反应包括以下组分: 样本 其中靶数量未知得样本。 标准品 数量已知得样本。 标准品稀释序列 一组用于构建标准曲线得标准品稀释液 (例如,1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32) 。 重复数 含有相同组分与量得相同反应数。 阴性对照 含有水或缓冲液得样本,不含模板;也称为 “无模板对照(NTC)”。阴性对照应不会扩增。2)为试剂选择 TaqMan® Reagents ( TaqMan 试剂)(包括两个引物一个探针) 。如果使用 TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择TaqMan® Reagents ( TaqMan 试剂) 。 TaqMan 试剂包括两个引物与一个TaqMan® 探针。 引物设计用于扩增靶。 TaqMan 探针设计用于杂交靶,并在扩增靶时产生荧光信号。切记！ Applied Biosystems 不建议将 TAMRATM 染料随 StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。如果使用 SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择 SYBR® Green Reagents ( SYBR Green 试剂)。 SYBR Green 试剂包括两个引物与 SYBR Green 染料。 引物设计用于扩增靶。 SYBR Green 染料可在结合到双链 DNA 时产生荧光信号。 SYBR Green 染料通常就是添加到反应得SYBR Green 母液得一部分。 如果使用 SYBR Green 染料:选择 Include Melt Curve (包括解链曲线)以执行扩增靶得解链曲线分析。将 Standard (标准)选为升降温速度。 Applied Biosystems 不提供 SYBRGreen 试剂得 Fast 母液。3)为升降温速度选择 Standard (2 hours to plete a run) (标准 (约两小时完成运行) 。 如果为 PCR 反应使用 Fast 试剂,则选择 Fast (40 Minutes toplete a Run) (快速 (约 40 分钟完成运行) )。 如果为 PCR 反应使用标准试剂 (包括 SYBR Green 试剂与 TaqMan 试剂) ,则选择 Standard (2 Hours to plete a Run) (标准 (约 2 小时完成运行) 。4)为模板类型选择 gDNA (genomic DNA) ( gDNA (基因组 DNA) ) 。5)Next> (下一步) 。3、设置靶在 Targets (靶)屏幕上,输入您想在 PCR 反应板中定量得靶数量,然后为每个靶设置检测。1)单击 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? (您想在反应板中定量多少靶？)字段,然后输入 1(根据需要填)。注意: 靶检测表中得行数将以您输入得数字更新。2)选择 Set Up Standards (设置标准品)复选框,以为靶检测设置标准品。建议反应板中得每个靶检测设置一条标准曲线。注意: Set Up Standards (设置标准品)复选框默认情况下已选取。3)设置靶 1 检测:a、 单击 Enter Target Name (输入靶名称)单元格,然后输入 RNase P(示例)。b、 从 Reporter (报告基团)下拉菜单中,选择 FAM (默认) 。 如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶得 TaqMan 探针得 5 端,则选择FAM。 如果要将 JOETM 染料加在您用于检测靶得 TaqMan 探针得 5 端,则选择JOE。 如果要将 VIC® 染料加在您用于检测靶得 TaqMan 探针得 5 端,则选择VIC。 如果您正使用 SYBR® Green 染料以检测双链 DNA,则选择 SYBR。c、 从 Quencher (淬火基团)下拉菜单中,选择 NFQMGB (默认) 。 如果要将非荧光淬火基团小沟结合物加在您正用于检测靶得 TaqMan 探针得 3 端,则选择 NFQMGB。 如果您正使用 SYBR Green 染料,则选择 None (无) 。4)Next> (下一步) 。4、设置标准品在 Standards (标准品)屏幕上,为所有标准曲线输入反应板中得点数与重复数。对于每条标准曲线,输入起始量并选择序列倍数。1)单击 How many points do you need for each standard curve? (每条标准曲线您需要多少个点？)字段,然后输入 5。建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。2)单击 How many replicates do you need for each point? (每个点您需要多少次重复反应？)字段,然后输入 3。建议每个点三次重复反应。3)为 RNase P (示例)检测定义标准品数量范围:a、 单击 Enter Starting Quantity (输入起始量)字段,然后输入 10000。由于标准品数量得范围会影响扩增效率计算,因此应仔细为您得检测考虑标准品数量得适当范围: 为了更准确地测量扩增效率,请使用大范围得标准品数量,扩大到 5 个至6 个对数级之间。 如果您为标准品指定大范围得数量,您需使用 PCR 产物或高度浓缩得模板,如 cDNA 克隆。 如果您得 cDNA 模板数量有限且/或靶就是低拷贝数转录物,或已知在给定范围之内,则可能需要小范围得标准品数量。b、 从 Select Serial Factor (选择序列倍数)下列菜单中,选择 1:2。序列倍数用于计算标准曲线所有点中得数量。 如果您得起始数量就是最高数量,则选择如 1:2、 1:3 之类得稀释倍数。 如果您得起始数量就是最低数量,则选择如 2X、 3X 之类得浓缩倍数。4)查瞧 Standard Curve Preview (标准品曲线预览)窗格。 标准曲线应包含如下点:10000、 5000、 2500、 1250 与 625。5)Next> (下一步) 。5、设置样本在 Samples (样本)屏幕上,输入反应板中要包括得样本、重复数与阴性对照数,然后选择样本/靶反应以进行设置。1)单击 How many samples do you want to test in the reaction plate? (您想在反应板中检测多少样本？)字段,然后输入 2。(根据需要填)2)单击 How many replicates do you need? (您需要多少次重复反应？)字段,然后输入 3。建议对每个样本反应重复三次反应。3)单击 How many negative controls do you need for each target assay? (每个靶检测您需要多少阴性对照？) ,然后输入 3。建议对每个靶检测进行三次阴性对照反应。4)4、 设置样本 1:a、 单击 Enter Sample Name (输入样本名)字段,然后输入 pop1 (用于重复组 1) 。b、 保留 Color (颜色)字段中得默认设置。5)设置样本 2:a、 单击 Enter Sample Name (输入样本名)字段,然后输入 pop2 (用于重复组 2) 。b、 保留 Color (颜色)字段中得默认设置。6)选择 All Sample/Target Reactions (所有样本/靶反应)以检测所有样本中得所有靶。 选择 All Sample/Target Reactions (所有样本/靶反应)以检测所有样本中得所有靶。 选择 Specify Sample/Target Reactions (指定样本/靶反应)以指定每个样本中要检测得靶。7)在 Well Count (反应孔数)窗格中,确认存在: 6 个未知反应孔U 15 个标准品反应孔S 3 个阴性对照反应孔N 24 个空反应孔8)在 View Plate Layout (查瞧检测板布局)选项卡上:a、 从 Arrange Plate by (反应板布局方式)下拉菜单中,选择 Rows (按行)(默认) 。b、 从 Place Negative Controls (放置阴性对照)下拉菜单中,选择 Upper Left(左上角) (默认) 。9)Next> (下一步) 。6、设置运行方式在 Run Method (运行方法)屏幕上,查瞧默认运行方法得反应体积与温度变化过程设置。 若需要,您可调整默认运行方法或用 Run Method (运行方法)库中得某种方法进行替换。1)单击选择 Graphical View (图形视图)选项卡 (默认)或 Tabular View (表格视图)选项卡。2)单击 Reaction Volume Per Well (每个反应孔得反应体积)字段,然后输入 25 µL。为 “反应体积/反应孔”输入介于 10 至 30 得值。 StepOne 系统支持 10 至30 µL 之间得反应体积。3)确保温度变化过程设置显示保持与循环阶段。 确保温度变化过程设置适合试剂。 如果正执行一步法 RTPCR 扩增,则包括一个反转录步骤。如果实验需要一个不同得温度变化过程设置,调整温度变化过程设置或用Run Method (运行方法)库中得某个温度变化过程设置进行替换。 Run Method(运行方法)库包括在 StepOne 软件中。4)Next> (下一步) 。7、查瞧反应设置在 Reaction Setup (反应设置)屏幕上,选择检测类型 (如果使用 TaqMan 试剂),然后查瞧为准备 PCR 反应、标准稀释序列与样本稀释而计算得剂量。 若需要,您可调整反应体积、额外反应体积、组分浓度、标准品浓度与/或稀释后样本浓度。切记！ 对反应板中得每个靶检测执行这些步骤。完成 Reaction Mix Calculations (反应预混液计算)选项卡1)选择 Reaction Mix Calculations (反应预混液计算)选项卡 (默认)。 2)从 Select Target (选择靶)窗格中,选择 RNase P。3)从 Assay Type (检测类型)下拉菜单中,选择 Inventoried/Made to Order(库存/定制) 。如果正使用 TaqMan 试剂,选择所使用得检测类型: 如果正使用 Applied Biosystems TaqMan® Gene Expression Assays (库存/定制)或 Applied Biosystems Custom TaqMan® Gene Expression Assays,则选择 Inventoried/Made to Order (库存/定制)。 如果正使用 Primer Express® 软件设计检测,则选择 Custom(定制)。4)确认 Reaction Volume Per Well (每个反应孔得反应体积)字段中显示 25 µL。为 “反应体积/反应孔”输入介于 10 至 30 得值。 StepOne 系统支持 10 至30 µL 之间得反应体积。5)确认 Excess Reaction Volume (额外反应体积)字段中显示 10%。包括额外反应体积以弥补移液过程中得损失。建议至少准备 10% 得额外反应体积。6)在 Reactions for RNase P ( RNase P 反应)窗格中:a、 确认 Master Mix Concentration (母液浓度)字段中显示 2、0X。b、 确认 Assay Mix Concentration (检测预混液浓度)字段中显示 20、0X。c、 查瞧 PCR 反应得组分与计算得剂量。7)在 Standard Dilution Series for RNase P ( RNase P 得标准品稀释序列)窗格中:a、 单击 Standard Concentration in Stock (储液中标准品得浓度)字段,然后输入 20000。b、 单击 units (单位)字段,然后输入 copies per µL。c、 查瞧为准备标准品稀释序列计算得剂量。完成 Sample Dilution Calculations (样本稀释计算)选项卡1)选择 Sample Dilution Calculations (样本稀释计算)选项卡。2)单击 Diluted Sample Concentration (10X for Reaction Mix) (稀释后样本浓度)(对于反应预混液为 10X) ,然后输入 6、6。3)从单位下拉菜单中,选择 ng/µL (默认) 。4)查瞧为样本稀释计算得剂量。8、实验材料订购在 Materials List (材料列表)屏幕上,查瞧建议用于准备 PCR 反应板得材料列表。或者,您可从 Applied Biosystems Store ( Applied Biosystems 产品仓库)订购所建议得材料。 创建购物篮,向购物列表中添加项目,然后登录以提交您得订单。 您必须具有不受限制得网络连接才能访问 Applied Biosystems Store ( AppliedBiosystems 产品仓库) 。1)在 Applied Biosystems Store ( Applied Biosystems 产品仓库)网站上查找靶检测套件:a、 确保您得计算机已连接到因特网。b、 单击 Enter Gene Name(输入基因名)字段,输入 RNase P,然后单击 FindAssay (查找检测套件) 。c、 在 Find Assay Results (发现检测套件结果)对话框中,选择您得检测套件。d、 单击 Apply Assay Selection (应用检测套件选择) 。2)完成 Experiment Materials List (实验材料列表)窗格:a、 从 Display (显示)下拉菜单中,选择 All Items (所有项) (默认) ,然后查瞧建议得材料。 若需要,使用右侧得滚动条查瞧所有项。3)用于进行定量实验得Inventoried/Made to Order 检测设计用于配合以下 TaqMan® 母液使用:TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2), No AmpErase® UNG,250 次反应,编号TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, 200 次反应,编号TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, 2000 次反应,编号10 包装 TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix,编号TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG,200 次反应,编号TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG,2000 次反应,编号10 包装 TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase®UNG,编号4)靶DNA 或 cDNA有几种 TaqMan 与 SYBR Green 试剂可用于定量实验。a、TaqMan® 试剂 TaqMan® Fast Universal PCR Master Mix (2), NoAmpErase® UNG, 250 次反应TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, 200 次反应,编号TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, 2000 次反应,编号10 包装 TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix ,编号TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, No,AmpErase® UNG, 200 次反应,编号TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix, NoAmpErase® UNG, 2000 次反应,编号10 包装 TaqMan® 2 Universal PCR Master Mix,No AmpErase® UNG,编号TaqMan® PCR Core Reagents Kit, 200 次反应,编号N8080228b、SYBR® Green 试剂Power SYBR® Green PCR Master Mix (1 mL),40 次反应,编号Power SYBR® Green PCR Master Mix (5mL),200 次反应,编号Power SYBR® Green PCR Master Mix(10 × 5mL), 2000 次反应,编号Power SYBR® Green PCR Master Mix (50 mL),2000 次反应,编号SYBR® Green PCR Master Mix (1mL), 40 次反应,编号SYBR® Green PCR Master Mix (5mL), 200 次反应,编号SYBR® Green PCR Master Mix (50mL), 2000 次反应,编号SYBR® Green PCR Core Reagents, 200 次反应,编号9、完成设计向导 要完成 Design Wizard (设计向导)工作流程,查瞧反应板布局,然后选择一个退出选项。1)在 Review Plate for Experiment (查瞧实验得反应板)窗口中,查瞧反应板布局。2)单击 Save Experiment (保存实验) 。3)在 Save Experiment (保存实验)对话框中,单击 Save (保存)以接受默认文件名与位置。 示例实验被保存并关闭,并且您返回到 Home (主页)屏幕。二、准备反应工作如何为标准曲线实验准备 PCR 反应。1、准备样本稀释在将样本添加到最终反应预混液之前,执行样本稀释。采用 StepOneTM 软件计算得剂量稀释样本。(样本稀释计算)根据储液中得样品浓度？ng/µL,Stepone软件计算出稀释剂量。因为在 StepOne 软件中,样本量仅限于反应总量得 10%,因此需要进行样本稀释。 反应总量为每次反应 25 µL,因此样本量为每次反应 2、5 µL。根据 “样本稀释计算”表稀释样本。1)所需材料 用于稀释样本得稀释液(TE缓冲液或水)、样本储液 微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机2)为每份拟稀释样本标记一个单独得微量离心管:Population 1、 Population 2等3)将所需剂量得稀释液添加到每个空反应管内。(14、2µL)4)将所需剂量得样本储液添加到每个反应管内。(1µL)5)振荡每份稀释得样本 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。6)将稀释后样本置于冰上,直到准备好反应板。2、准备标准品稀释序列 采用 StepOne 软件计算得剂量准备标准品稀释序列。(反应预混液计算)根据储液中得标准品浓度？copies/µL,Stepone软件计算出剂量。1)所需材料用于稀释标准品得稀释液(TE缓冲液或水)、标准品储液 微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机2)为每份标准品标记一个单独得微量离心管:Std、 1、Std、 2、Std、3、Std、 4、Std、 5。3)将所需剂量得稀释液添加到每个空反应管内:Std、 1(14、5µL)、Std、 2(9、1µL)、Std、3(9、1µL)、Std、 4(9、1µL)、Std、 5(9、1µL)。4)在Std、 1 反应管中准备稀释液 1:a、 振荡储液 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。b、 使用新得移液枪枪头,将 3、6 µL 储液添加到Std、 1 反应管中。c、 振荡 Std、 1 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。5) 在Std、 2 反应管中准备稀释液 2:a、 使用新得移液枪枪头,将 9、1 µL 稀释液 1 添加到Std、 2 反应管中。b、 振荡 Std、 2 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。6)在Std、 3 反应管中准备稀释液 3:a、 使用新得移液枪枪头,将 9、1 µL 稀释液 2 添加到Std、 3 反应管中。b、 振荡 Std、 3 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。7)在Std、 4 反应管中准备稀释液 4:a、 使用新得移液枪枪头,将 9、1 µL 稀释液 3 添加到Std、 4 反应管中。b、 振荡 Std、 4 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。8)在Std、 5 反应管中准备稀释液 5:a、 使用新得移液枪枪头,将 9、1 µL 稀释液 4 添加到Std、 5 反应管中。b、 振荡 Std、 5 反应管 3 至 5 秒,然后短暂地离心反应管。9)将标准品置于冰上,直到准备好反应板。3、准备反应预混液使用 StepOne 软件计算得组分与剂量准备反应预混液。(反应预混液计算)若实验包括一个以上得靶检测,则为每个靶检测单独准备反应预混液1)所需材料各反应预混液组分微量离心管、移液枪、移液枪枪头、离心机2)为反应预混液标记一个适当大小得反应管: Reaction Mix。3)将所需剂量得每种组分添加到反应管中:母液(2、0X)12、5µL、检测母液(20、0X)1、3µL、水8、8µL,总剂量22、6µL,加上10%得超额量2、26µL,共计24、86µL,24次反应所需剂量为596、6µL注意:将检测母液置于冰柜中避光储存,直到准备使用。 过多暴露在光线下会影响荧光探针。计算中包括额外剂量,以便为试剂转移期间发生得损失提供多余剂量。建议至少准备 10% 得超额量。4)用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合,然后盖上反应管盖。5)短暂地离心反应管以除去气泡。6)将反应预混液置于冰上,直到准备好反应板。注意:使用之前,请执行以下操作: 摇晃瓶子,彻底混合母液。 振荡反应管以重新悬浮检测母液,然后短暂地离心反应管。 将任何冷冻样本置于冰上将其解冻。 解冻时,进行振荡以重新悬浮样本,然后短暂地离心反应管。4、准备反应板为每个重复组准备反应物,然后将它们转移到反应板。 采用 StepOne 软件中显示得反应板布局。 1)所需材料反应预混液Reaction Mix、标准品、样本、水MicroAmpTM Fast Optical 48Well Reaction Plate MicroAmpTM Optical 48Well Adhesive Film微量离心管、移液枪、移液枪枪头、离心机2)准备靶阴性对照反应预混液:a、 向一个适当大小得反应管中,加入下面所列剂量得反应预混液与水。反应管反应预混液反应预混液剂量(µL)水量(µL)1Reaction mix74、68、3b、 用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合,然后盖上反应管盖。c、 短暂地离心反应管以除去气泡。d、 向反应板得相应反应孔中分别加入 25 µL 得阴性对照反应预混液。3)对于每个重复组,准备标准品反应预混液:a、 向适当大小得反应管中,加入下面所列剂量得反应预混液与标准品。反应管标准品反应预混液反应预混液反应预混液剂量(µL)标准品标准品剂量(µL)1Std 1Reaction mix74、6Std 18、32Std 2Reaction mix74、6Std 28、33Std 3Reaction mix74、6Std 38、34Std 4Reaction mix74、6Std 48、35Std 5Reaction mix74、6Std 58、3b、 用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合,然后盖上各反应管盖。c、 短暂地离心各反应管以除去气泡。d、 向反应板得相应反应孔中加入 25 µL 得标准品反应预混液。4)对于每个重复组,准备未知样本得反应预混液:a、 向适当大小得反应管中,加入下面所列剂量得反应预混液与样本。反应管未知样本反应预混液反应预混液反应预混液剂量(µL)样本样本剂量(µL)1pop1Reaction mix74、6pop18、32Pop2Reaction mix74、6Pop28、3b、 用移液枪轻轻吸入并排出反应预混液使其混合,然后盖上各反应管盖。c、 短暂地离心各反应管以除去气泡。d、 向反应板得相应反应孔中加入 25 µL 得未知 (样本)反应预混液。5) 用孔板高透光度盖膜密封反应板。6) 短暂地离心反应板以除去气泡。7) 在您准备好运行实验之前,将反应板置于阴暗处得冰上。注意:当您准备自己得标准曲线实验时: 确保您使用适当得耗材。 确保 PCR 反应得安排与 StepOne 软件中显示得反应板布局一致。 您可以: 接受软件自动生成得反应板布局。或 使用 Advanced Setup (高级设置)工作流程更改软件中得反应板布局。三、运行试验1、准备运行 打开实验并将密封得 MicroAmpTM Fast Optical 48Well Reaction Plate 装载到StepOneTM 扩增仪以准备运行。 1) 打开设计得实验a、打开StepOneb、从Home屏幕上,单击Openc、在Open对话框中,导航到experiments文件夹(默认)d、找到创建得试验设计,打开。2)装载反应板(带无粉手套)a、打开扩增仪抽屉b、将反应载体放置在样本加热块中。反应板得方向取决于您所用耗材得类型: 若使用一个反应板,让 A1 反应孔位于样本加热块得左后角。 若使用反应管条带,则将条带置于样本加热块中。c、 小心地关闭扩增仪抽屉。2、启动运行若计算机已通过 StepOne 系统线缆直接连接到 StepOne 扩增仪,则执行下列步骤。(并置启动)1)在 StepOne 软件中,单击 Temperature Plot (温度曲线) 。2)单击 START RUN (启动运行) 。3、监视运行 1)并置监视运行期间,定期查瞧 StepOne 软件提供得所有三条曲线就是否存在潜在问题。a、停止运行在 StepOne 软件中,单击 STOP RUN (停止运行)。对话框中包括: Stop Immediately (立即停止)以立即停止运行。 Stop after Current Cycle/Hold (当前循环 / 保持阶段后停止)以在当前循环或保持阶段之后停止运行。 Cancel (取消)以继续运行。b、 实时查瞧扩增数据Amplification Plot (扩增曲线)屏幕允许在 StepOne 扩增仪