多聚酶链式反应扩增DNA片段汇总课件.ppt
课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段DNA指纹法在案件侦破中有重要作用，刑侦人员通过案发现场的血液、头发等样品中提取的DNA，与犯罪嫌疑人的DNA进行比较，就有可能为案件的侦破提供证据。讨论：1.犯罪嫌疑人留在现场的样品一般都是极少量的，刑侦人员要怎样才能得到足够量的DNA呢？2.你还能说出DNA鉴定技术在其他方面的应用吗？分子生物学研究中最强大的实验技术之一分子生物学研究中最强大的实验技术之一其本质是在体外模拟细胞内其本质是在体外模拟细胞内DNADNA分子复制的过程分子复制的过程美美国国科科学学家家穆穆里里斯斯(KK.BB.MMuulllliiss)发发明明了了PPCCRR技技术术11999933 年年诺诺贝贝尔尔奖奖（一）DNA分子的结构C、H、O、N、P 1.元素组成：脱氧核苷酸 2.基本单位:一、基础知识脱氧核苷酸脱氧核苷磷酸脱氧核糖含氮碱基嘌呤嘧啶腺嘌呤（A）鸟嘌呤（G）胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T）一个核苷酸上的 一个核苷酸上的磷酸基团上的 磷酸基团上的“OH OH”和 和另一个核苷酸分子的第 另一个核苷酸分子的第3 3位碳原子 位碳原子上的羟基 上的羟基之间失去一分子水，形成 之间失去一分子水，形成磷酸二酯键，磷酸二酯键，即在 即在相邻的 相邻的两个脱氧核苷酸 两个脱氧核苷酸的 的3 3 和 和5 5 碳原子 碳原子之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过 之间形成磷酸二酯键。数量庞大的四种脱氧核苷酸通过3 3，5-5-磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。磷酸二酯键彼此连接起来形成脱氧核苷酸链。通常将 通常将DNA DNA的 的羟基 羟基“OH OH”末端称为 末端称为3 3 端，而磷酸基团的末端称为 端，而磷酸基团的末端称为5 5 端 端3.脱氧核苷酸链的形成脱氧核苷酸链结构简图DNA分子的平面结构ATGCAGCT氢 氢键 键5端3端5端3端 识别：-OH端为3;磷酸基团的末端为5。（1）DNA分子是由 的（即一条链为35，另一条链为53）脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则 结构。4.DNA双螺旋结构特点：（2）与 交替连结，排列在外侧，构成基本骨架；排列在链的内侧。（3）两条链上的碱基通过 连结起来，形成碱基对。碱基对的组成有特定的规律：即腺嘌呤（A）一定与 配对，鸟嘌呤（G）一定同 配对。两条反向平行双螺旋脱氧核糖 磷酸碱基氢键胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）（二）DNA的复制：1.概念：由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程。2.时期：有丝分裂间期，减数第一次分裂前的间期。3.场所：细胞核（主要）、线粒体、叶绿体4.基本条件：酶:解旋酶、DNA聚合酶能量:ATP原料:四种脱氧核苷酸模板:DNA的两条链5.复制特点：a.边解旋边复制b.半保留复制6.遵循原则：碱基互补配对原则7.精确复制的原因a.规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板b.碱基互补配对保证了复制准确无误的进行8.复制的意义:DNA分子通过复制将遗传信息从亲代传给了后代，保持了遗传信息的连续性。参与的组分参与的组分在在DNADNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶DNADNA母链母链44种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸DNADNA聚合酶聚合酶引物引物总结：细胞内DNA复制的基本体系打开打开DNADNA双链双链提供提供DNADNA复制的模板复制的模板合成子链的原料合成子链的原料催化合成催化合成DNADNA子链子链使使DNADNA聚合酶能够从引物的聚合酶能够从引物的33端开始连接脱氧核苷酸端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链的原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3端开始连接脱氧核苷酸 思考：体外扩增DNA时，如何提供与体内DNA复制相似条件？变性（80100）Taq DNA聚合酶（耐高温）2030个核苷酸构成DNA或RNA二、PCR（多聚酶链式反应）（一）PCR原理DNA双链变性（加热80-100）复性（缓慢冷却）DNA单链变性的目的：解开双链复性的目的：有利于引物1和引物2与两条单链的结合PCR扩增仪PCR扩增仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。1 2 3 4 522557294时间（min）温度（）适温延伸高温变性低温复性重复13步30轮DNA复制的方向：DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸变性 复性（退火）延伸（二）PCR的反应过程：（二）PCR的反应过程 5/3/3/5/5/3/引物5/3/引物变性95oC复性55oC延伸72oC5/3/3/5/5引物15 引物2第二次复制第一次复制55 55 5 5模板DNA55 555 5 552530 次循环（复制）后，模板DNA 的含量可以扩大100万（220）倍以上。DNA母链：解旋酶(条件）：4种脱氧核苷酸：DNA聚合酶（条件）：ATP：引物：缓冲溶液适宜温度（三）PCR反应的条件80100：耐热的DNA聚合酶三、PCR实验操作1、PCR仪（一）设备及用具2、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体，其其上的一次性吸液枪头用一次更换一次上的一次性吸液枪头用一次更换一次实质上是能够自动调控温度的仪器4、离心机一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。（1）按配方将所需试剂摆放在实验桌上（准备）（2）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（移液）（3）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（混合）（4）将微量离心管放在离心机上（离心）（5）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序（反应）循环数 循环数 变性 变性 复性 复性 延伸 延伸第一次 第一次 94 94，5min 5min 30 30次 次 94 94，30s 30s 55 55，30s 30s 72 72，1min 1min最后一次 最后一次 4 4，1min 1min 55 55，30s 30s 72 72，1min 1min（二）操作步骤：四、结果分析与评价DNA 含量的测定：稀释 对照调零 测定 计算50倍蒸馏水做对照波长260nm处读数（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2 n2、a条DNA，复制n次，DNA为a x2 n（二）实验中DNA含量的测定1、原理 可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关光吸收波长nm 260 240 220 2800.10.22、过程稀释2L PCR反应液，加入98L L蒸馏水，即将样蒸馏水，即将样品进行品进行5050倍稀释倍稀释对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值处的光吸收值测定并计算计算DNADNA含量（含量（gg/mL/mL）5050(260nm(260nm的读数的读数)稀释倍数稀释倍数50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1,DNA 的含量为50 g/mL紫外分光光度计 比色杯体内DNA复制与PCR的技术区别：体内复制 PCR技术解旋 在解旋酶作用下，细胞提供ATP，部分解开加热到94oC,双链全部解开，不需解旋酶引物 一小段RNA 一般用DNA片段DNA聚合酶 细胞自身的DNA聚合酶（不耐高温）TaqDNA聚合酶复制特点 半保留复制，边解旋边复制，多起点复制。半保留复制，完全解旋后复制，从模板链的一端开始复制。复制的方向 子链的5端向 3端延伸子链的5端向 3端延伸课堂小结多聚酶链式反应扩增 DNA片段PCR原理DNA的复制需要酶、原料、能量、引物DNA的变性和复性受温度影响PCR过程变性 复性 延伸操作步骤 配制PCR反应体系 移入离心管放入PCR仪 仪设置工作参数DNA扩增测定含量 稀释 调零 测定并读数 计算课堂练习填空题1.PCR仪加热使（）变性,复性使引物与模板DNA（）,延伸需将反应温度升至中温(),在（）的作用下,以（）为原料合成新链。2.PCR经（）三个阶段为一个循环。DNA互补72 Tap酶 4种dNTP变性、复性、延伸选择题1.PCR反应产物的特异性取决于()A退火温度 B引物碱基组成和长度C循环次数 D.A+B+CD2.PCR实验的特异性主要取决于（）A.DNA聚合酶的种类 B.反应体系中模板DNA的量C.引物序列的结构和长度D.四种dNTP的浓度C3.做PCR使用的微量离心管、枪头、缓冲液及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是 A.反复洗涤 B.不怕外源DNA污染 C.高压灭菌 D.在-20储存4.PCR技术最突出的优点是 A.原理简单 B.原料易获得 C.Taq DNA聚合酶有耐热性 D.快速、高效、灵活、易于操作
