基因工程步骤ppt课件.ppt

基因操作的基本步骤基因工程的基本过程 基因操作的基本步骤1）获得目的基因（目的基因的获取）2）制备重组DNA分子（基因表达载体的构建）3）转化受体细胞（将目的基因导入受体细胞）4）筛选重组细胞5）实现功能表达 目的基因的检测和表达目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因限制酶(一）获得目的基因 目的基因的提取方法直接分离基因人工合成基因反转录法根据已知的氨基酸序列合成DNA：鸟枪法1）鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(散弹射击法、直接分离法)用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。基因组DNA文库cDNA文库基因组DNA文库与cDNA文库的比较 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA单链DNA(cDNA)双链DNA(即目的基因)反转录反转录合成合成2）反转录法：3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA 的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点 缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA 序列自动测序仪：2）PCR 技术：对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增。PCR 可以把 指定的基因片段 数量放大染色体PCR 基因放大连琐反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)2）聚合酶链式反应即PCR技术（二）基因表达载体的构建基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点o 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质结构基 因RNA 聚合酶半乳糖苷酶 酶 酶 RNA 聚合酶启动子RNA 聚合酶终止子：位于基因的尾端的一段特殊 的DNA片断，能终止mRNA的 转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来目的基因载体限制性内切酶T4 DNA 连接酶15C重组体载体自连目的基因 自连基因组（三）目的基因导入受体细胞 常用的受体细胞：有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。转化 目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程受体细胞稳定 表达方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法（2）程序：