中药注射剂对豚鼠离体回肠的收缩作用操作规程(T-TPPA 0003—2022).pdf

ICS 11.120.01 CCS C27 团 体 标 准 T/TPPA 0003-2022 中药注射剂对豚鼠离体回肠的收缩作用操作规程 Operating procedure for contraction of traditional Chinese medicine injection on isolated ileum of guinea pig 2022-12-22 发布 2022-12-22 实施 T/TPPA 0003-2022 目 次 前 言.I 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 检测原理.2 5 材料与设备.2 5.1 材料.2 5.2 设备.2 6 实验方法.2 6.1 溶液配制.3 6.2 实验步骤.3 7 数据处理及判定.5 天津市医药行业协会 发布 T/TPPA 0003-2022 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由天津天士力之骄药业有限公司提出。本文件由天津市医药行业协会归口。本文件起草单位：天津天士力之骄药业有限公司、天津大学、天津市药品检验研究院、天津市中药注射剂安全性评价企业重点实验室、创新中药关键技术国家重点实验室、现代中医药海河实验室、河南天地药业股份有限公司、天津红日药业股份有限公司。本文件主要起草人：鞠爱春、高文远、华晓东、李霞、李德坤、岳洪水、张俊华、周水平、王娟、周立华、万梅绪、郑文科、王冲、徐琳、张燕欣、李智、何毅、白晓丽、马晓慧、王蕴华、黄芝娟、江昕、张松梅。T/TPPA 0003-2022 1 中药注射剂对豚鼠离体回肠的收缩作用操作规程 1 范围 本文件规定了静息豚鼠离体回肠，乙酰胆碱、组胺、氯化钾和氯化钙诱导的豚鼠离体回肠的实验方法。本文件适用于中药注射剂对豚鼠离体回肠收缩作用的评价。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 14925 实验动物 环境及设施 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 24001 环境管理体系 要求及使用指南 GB/T 45001 职业健康安全管理体系 要求及使用指南 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。3.1 乙酰胆碱 acetylcholine 乙酰胆碱是一种神经递质。在组织内迅速被胆碱酯酶破坏。能特异性地作用于各类胆碱受体。3.2 组胺 histamine 组胺是一种有机含氮化合物，是由组氨酸在脱羧酶的作用下产生的。许多组织，特别是皮肤、肺和肠黏膜的肥大细胞中含有大量的组胺。当组织受到损伤或发生炎症和过敏或类过敏反应时，都可释放组胺。组胺有强烈的刺激血管作用，并能使毛细血管和微静脉的管壁通透性增加，血浆漏入组织，导致局部组织水肿。T/TPPA 0003-2022 2 3.3 毒蕈碱受体 muscarinic receptor 毒蕈碱受体简称M受体，广泛存在于副交感神经节后纤维支配的效应器细胞上。当乙酰胆碱与这类受体结合后，可产生一系列副交感神经末梢兴奋地效应，包括心脏活动的抑制，支气管平滑肌、胃肠道平滑肌、膀胱逼尿肌和瞳孔括约肌的收缩，以及消化腺分泌增加等。3.4 组胺1型受体 histamine receptor 1 组胺1型受体简称H1受体，是组胺受体的一种亚型，组胺通过激活H1受体产生支气管平滑肌兴奋、毛细血管通透性增加和部分血管扩张效应。临床常用H1受体阻断药物治疗皮肤黏膜过敏反应。4 检测原理 乙酰胆碱和组胺是引起回肠平滑肌收缩及诱发变态反应的主要递质。乙酰胆碱和组胺为M1、H1受体完全激动剂，分别与M1受体和H1受体结合，通过G蛋白介导激活磷脂酶C，使4,5二磷酸肌醇磷脂水解为二酰甘油及1,4,5-三磷酸肌醇。二酰甘油在细胞膜上激活蛋白激酶C，使靶蛋白磷酸化，激活钙通道，使细胞外Ca2+内流增加，从而导致回肠平滑肌收缩。5 材料与设备 5.1 材料 5.1.1 实验动物 豚鼠，雌雄均可，体重200g50g，实验用豚鼠在18-29条件下适应性饲养3d后进行实验，动物饲养符合GB 14925和GB/T 24001的要求，动物实验符合GB 19489和GB/T 28001的要求。5.1.2 试剂试药 a）乙酰胆碱：含量不低于99.0%。b）组胺：含量不低于97.0%。c）氯化钾、氯化钙、氯化钠、氯化镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、葡萄糖，上述试剂均 为分析纯。d）水为 GB/T 6682 规定的三级水。5.2 设备 组织器官灌流装置、生物信号采集系统。6 实验方法 T/TPPA 0003-2022 3 6.1 溶液配制 6.1.1 台氏液的配制 称取氯化钠 8.01g、氯化钾 0.20g、氯化钙 0.20g、氯化镁 0.10g、碳酸氢钠 1.00g、磷酸二氢钾0.05g、葡萄糖 1.01g，溶解并定容至 1000mL，调节至 pH 至 7.4，24h 内使用。6.1.2 乙酰胆碱溶液的配制 称取乙酰胆碱适量，加水配制成适宜浓度的乙酰胆碱溶液。6.1.3 组胺溶液的配制 称取组胺适量，加水配制成适宜浓度的组胺溶液。6.1.4 氯化钾溶液的配制 称取氯化钾适量，加水配制成适宜浓度的氯化钾溶液。6.1.5 氯化钙溶液的配制 称取氯化钙适量，加水配制成适宜浓度的氯化钙溶液。6.2 实验步骤 6.2.1 离体标本制备 豚鼠适应性饲养 3d，实验前禁食 12h，自由饮水。每组选择体重在 200g50g 的豚鼠 610 只，处死后，5min 内取出回肠，在距回盲部 10cm 处取出约 10cm 的一段回肠，将内容物用 0台氏液冲洗干净，剪取 3 段约 2cm 的肠段。用细线将肠段一端悬挂于通气挂钩，另一端与张力换能器相连，置于盛放有 37台氏液的麦氏水浴槽中，并缓慢通入 95%氧气和 5%二氧化碳的混合气体，控制气体流速在 23个气泡/秒。调整前负荷在 1.5g，用生物信号采集系统平衡 1h15min，期间每 20min 更换一次新鲜的台氏液，待回肠平滑肌自发性收缩运动处于平衡状态后，进行后续实验。6.2.2 供试品对静息离体回肠影响的评价 平衡后的离体回肠段中，加入适宜浓度的供试品（20400L，可根据供试品的溶解度进行适当调整，后续实验与该体积保持一致），每次加药后平衡 3min，记录平滑肌收缩曲线，通过张力值参数比较作用强弱。加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明所加入的供试品对静息离体回肠平滑肌的收缩有抑制作用。按照如下公式计算抑制率：抑制率(%)=(G给药前-G给药后)/G给药前100%式1 式中：G给药前给药前回肠收缩平均张力 G给药后给药后回肠收缩平均张力 T/TPPA 0003-2022 4 抑制率越大表明供试品对静息离体回肠平滑肌收缩的抑制作用越强。6.2.3 供试品对乙酰胆碱诱导的离体回肠收缩影响的评价 a)乙酰胆碱诱导的离体回肠收缩模型的建立 待回肠平滑肌收缩曲线稳定后，加入10-810-4mol/L的乙酰胆碱溶液，平衡3min，记录加入乙酰胆碱溶液前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化。加入乙酰胆碱溶液后收缩张力明显升高，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明乙酰胆碱诱导的离体回肠收缩模型制备成功。b)供试品对乙酰胆碱诱导的豚鼠离体回肠平滑肌收缩的影响 在造模后离体回肠中加入适宜浓度的供试品，平衡3min，记录供试品加入前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化，通过张力值参数比较作用强弱。加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明所加入的供试品对乙酰胆碱诱导的平滑肌收缩有抑制作用。按照 6.2.2 项下式 1 计算抑制率，抑制率越大表明供试品对乙酰胆碱诱导的离体回肠平滑肌收缩的抑制作用越强。6.2.4 供试品对组胺诱导的离体回肠收缩影响的评价 a)组胺诱导的离体回肠收缩模型的建立 待回肠平滑肌收缩曲线稳定后，加入10-810-4mol/L的组胺溶液，平衡3min，记录加入组胺溶液前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化。加入组胺溶液后收缩张力明显升高，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明组胺诱导的离体回肠收缩模型制备成功。b)供试品对组胺引起的豚鼠离体回肠平滑肌收缩的影响 在造模后离体回肠中加入适宜浓度的供试品，平衡3min，记录供试品加入前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化，通过张力值参数比较作用强弱。加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明所加入的供试品对组胺诱导的平滑肌收缩有抑制作用。按照6.2.2项下项下式1计算抑制率，抑制率越大表明供试品对组胺诱导的离体回肠平滑肌收缩的抑制作用越强。6.2.5 供试品对氯化钾诱导的离体回肠收缩影响的评价 a)氯化钾诱导的离体回肠收缩模型的建立 待回肠平滑肌收缩曲线稳定后，加入10-510-1mol/L的氯化钾溶液，平衡3min，记录加入氯化钾溶液前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化。加入氯化钾溶液后收缩张力明显升高，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明氯化钾诱导的离体回肠收缩模型制备成功。b)供试品对氯化钾诱导的豚鼠离体回肠平滑肌收缩的影响 在造模后离体回肠中加入适宜浓度的供试品，平衡3min，记录供试品加入前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化，通过张力值参数比较作用强弱。加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明所加入的供试T/TPPA 0003-2022 5 品对氯化钾诱导的平滑肌收缩有抑制作用。按照 6.2.2 项下式 1 计算抑制率，抑制率越大表明供试品对氯化钾诱导的离体回肠平滑肌收缩的抑制作用越强。6.2.6 供试品对氯化钙诱导的离体回肠收缩影响的评价 a)氯化钙诱导的离体回肠收缩模型的建立 待回肠平滑肌收缩曲线稳定后，加入10-410-1mol/L的氯化钙溶液平衡3min，记录加入氯化钙溶液前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化。加入氯化钙溶液后收缩张力明显升高，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明氯化钙诱导的离体回肠收缩模型制备成功。b)供试品对氯化钙引起的豚鼠离体回肠平滑肌收缩的影响 在造模后离体回肠中加入适宜浓度的供试品，平衡3min，记录供试品加入前后3min内离体回肠平滑肌收缩张力的变化，通过张力值参数比较作用强弱。加入供试品后收缩张力明显降低，且与加入前相比有显著性差异（P0.05），表明所加入的供试品对氯化钙诱导的平滑肌收缩有抑制作用。按照6.2.2项下式1计算抑制率，抑制率越大表明供试品对氯化钙诱导的离体回肠平滑肌收缩的抑制作用越强。7 数据处理及判定 对各组实验数据进行单因素方差统计学分析，实验数据以xs表示。各给药组给药前后进行比较，P0.05 表示存在显著性差异。当供试品对乙酰胆碱、氯化钾、氯化钙和组胺诱导的4种离体回肠收缩模型中的一种或一种以上具有抑制作用，判定该供试品对豚鼠离体回肠平滑肌收缩具有抑制作用。