α-淀粉酶的发酵、提取和.ppt
-淀粉酶的发酵、提取和活性测定淀粉酶的发酵、提取和活性测定 背景知识n淀淀粉粉酶酶是是水水解解淀淀粉粉和和糖糖原原酶酶类类的的总总称称，广广泛泛存存在在于于动动植植物物和和微微生生物物中中。-淀淀粉粉酶酶作作用用于于淀淀粉粉时时，可可从从分分子子内内部部切切开开-1，4键键而而生生成成糊糊精精和和还还原原糖糖。产产物物的的末末端端葡葡萄萄糖糖残残基基C1碳碳原原子子为为-构构型型，故故称称-淀淀粉粉酶酶。如如枯枯草草杆杆菌菌BF7658-淀淀粉粉酶酶，广广泛泛应应用用于于食食品品、酿酿造造、制制药药、纺纺织织以以至至石石油油开开采采等等许多方面。许多方面。n一、实验目的一、实验目的n通通过过以以-淀淀粉粉酶酶的的发发酵酵生生产产为为实实例例，学学习习和和掌掌握握酶酶的的液液体体发发酵酵和和盐盐析析沉沉淀淀法法提提取取纯纯化化的的基基本本原原理理和和过过程程，掌掌握握-淀淀粉粉酶分析方法、发酵和提取的评价标准。酶分析方法、发酵和提取的评价标准。n二、实验原理二、实验原理n1、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉、工业生产中酶的提取多数采用盐析沉淀法，即：通过加入不同的金属盐破坏淀法，即：通过加入不同的金属盐破坏酶的水化层同时中和酶的表面电荷，而酶的水化层同时中和酶的表面电荷，而使酶快速的形成沉淀，得到分离纯化。使酶快速的形成沉淀，得到分离纯化。本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适本实验通过向枯草杆菌发酵液中加入适量的硫酸铵，对发酵液中的胞外量的硫酸铵，对发酵液中的胞外-淀粉淀粉酶进行纯化提取。酶进行纯化提取。n2.在碱性溶液在碱性溶液(NaOH)中，双缩脲中，双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与能与Cu2+作用，作用，形成紫色或紫红色的络合物，这个反应形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键（有很多与双缩脲结构相似的肽键（CONH），），因此，蛋白质可与双缩脲试因此，蛋白质可与双缩脲试剂发生颜色反应。剂发生颜色反应。此络合物在此络合物在540nm吸吸收值在一定范围内与蛋白质的质量成正收值在一定范围内与蛋白质的质量成正比比.n3.淀粉在碘液中会呈现紫色淀粉在碘液中会呈现紫色。-淀粉酶淀粉酶作用于淀粉时，可从分子内部切开作用于淀粉时，可从分子内部切开-1，4键而生成糊精和还原糖。而糊精和还原键而生成糊精和还原糖。而糊精和还原糖在碘液中不显色，故可通过预先盛有糖在碘液中不显色，故可通过预先盛有淀粉和比色稀碘液的试管中的颜色变化淀粉和比色稀碘液的试管中的颜色变化（由紫色变棕色）来辨别反应终点。（由紫色变棕色）来辨别反应终点。n三、实验步骤三、实验步骤n 1.硫酸铵沉淀法从发酵液中分离硫酸铵沉淀法从发酵液中分离-淀粉酶淀粉酶。n先先将将固固体体硫硫酸酸铵铵研研成成细细粉粉末末，然然后后按按37%（重重量量/体体积积比比）的的比比例例加加入入到到经经离离心心的发酵液中，混合均匀，的发酵液中，混合均匀，静置静置30min。n具具体体操操作作:5ml发发酵酵液液,加加1.87克克硫硫酸酸铵铵细细粉粉末末,混匀混匀,静置静置30min.n两两组组配配平平,4000r.m.p离离心心10分分钟钟,离离心心去去除除上上清清液液保保留留沉沉淀淀。测测活活前前加加入入10ml去去离离子水溶解。子水溶解。(即稀释一倍即稀释一倍)n注注意意:(剩剩下下的的溶溶液液留留下下来来用用于于下下一一次次测测蛋蛋白含量白含量)n2.双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线双缩脲法绘制小牛血清白蛋白标准曲线n取取7支试管，编号，按下表加入试剂：支试管，编号，按下表加入试剂：n震震荡荡1515分分钟钟，室室温温静静置置3030分分钟钟后后，540540nmnm比比色色，以以蛋蛋白白质质含含量量（mg/mlmg/ml）为为横横坐坐标标，吸吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。光度为纵坐标，绘制标准曲线。试试 剂剂管管 号号1 12 23 34 45 56 67 7标准蛋白溶液标准蛋白溶液（mlml）0.00.00.20.20.40.40.60.60.80.81.01.00.5 0.5 ml(ml(待测蛋白待测蛋白)+0.5+0.5 mlml（0.1M0.1M NaOH NaOH）0.050.05M M NaOH NaOH（mlml）1.01.00.80.80.60.60.40.40.20.20.00.0双缩脲试剂（双缩脲试剂（mlml）4.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白含量（蛋白含量（mg/mlmg/ml）0.00.01.01.02.02.03.03.04.04.05.05.0?n2.取发酵液取发酵液5ml+5ml去离子水去离子水(即稀释一倍即稀释一倍)n3.分别测定发酵液和提取液中的分别测定发酵液和提取液中的-淀粉酶的酶活并淀粉酶的酶活并计算它们各自的酶比活力计算它们各自的酶比活力n-淀粉酶的酶活测定淀粉酶的酶活测定n（1）吸取）吸取1ml标准糊精溶液，置于盛有标准糊精溶液，置于盛有3ml标准标准稀碘液的试管中稀碘液的试管中n（2）在试管中加入在试管中加入2%可溶性淀粉可溶性淀粉20ml,加缓冲加缓冲液液5ml,在在60度水浴中平衡度水浴中平衡4-5分钟分钟,加入加入0.5ml稀释酶稀释酶液液,立即记时立即记时,充分混匀充分混匀,1分钟后取出分钟后取出1ml反应液于预反应液于预先盛有先盛有3ml比色稀碘液的试管内比色稀碘液的试管内(也需放在水浴中也需放在水浴中),当颜色反应由紫色逐渐变成棕色当颜色反应由紫色逐渐变成棕色,与标准比色管颜色与标准比色管颜色相同时相同时,记录时间为反应时间记录时间为反应时间(发酵液和提取液每组发酵液和提取液每组各做各做2个重复个重复)计算计算:酶活性单位酶活性单位:以以1克酶粉或克酶粉或1ml酶液于酶液于60度度,pH为为6.0的条件下的条件下,在在1小时内液化可溶性淀小时内液化可溶性淀粉的克数表示粉的克数表示淀粉酶活力单位淀粉酶活力单位=(60/t*20*2%*f)/0.5=48*f/t试中试中f表示酶的稀释倍数表示酶的稀释倍数,t为反应时间为反应时间活活性性回回收收率率=（提提取取液液酶酶活活提提取取液液体体积积）/（发发酵酵滤滤过过液液酶酶活活用用于于盐盐析析沉沉淀淀的的发发酵酵滤滤过过液体积）液体积）n四、四、思考题思考题n1 1活性回收率通常小于活性回收率通常小于1 1，有没有可能大于，有没有可能大于1 1，为什么？，为什么？n2.2.双缩脲法测定蛋白质质量，只与待测蛋白质双缩脲法测定蛋白质质量，只与待测蛋白质质量有关，而与分子量无关，为什么？质量有关，而与分子量无关，为什么？n实验报告实验报告n清洁清洁n
