Lowry’s法Folin-酚试剂法-测定血清中蛋白质的含量.ppt

怎样测定血清中怎样测定血清中蛋白质蛋白质的含量的含量蛋白质含量测定的常用方法比较蛋白质含量测定的常用方法比较方方 法法 灵敏度灵敏度 优点优点 缺点缺点凯氏定氮法凯氏定氮法0.2 1.0mg 干扰少，干扰少，准确准确操作复杂，费时操作复杂，费时 紫外吸收法紫外吸收法50100mg 快速简便快速简便无损样品无损样品灵敏度低灵敏度低干扰物较多干扰物较多考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法（Bradford法）法）15ug 灵敏、简灵敏、简便、快速便、快速不同蛋白质测定时不同蛋白质测定时有较大的偏差有较大的偏差 双缩脲法双缩脲法 120mg 干扰相对干扰相对少，较快少，较快灵敏度低灵敏度低LowryLowry法法法法2020250ug 250ug 灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度高干扰物质多、费时、干扰物质多、费时、干扰物质多、费时、干扰物质多、费时、操作严格计时操作严格计时操作严格计时操作严格计时选择测定方法时应考虑：选择测定方法时应考虑：l1、实验样品对测定所要求的灵敏度和精确度；l2、蛋白质的性质；l3、溶液中存在的干扰物质；l4、测定所花费的时间等。Lowrys法（法（Folin-酚试剂法）酚试剂法）测定蛋白质含量测定蛋白质含量Determination of protein content by Lowrys method实验目的实验目的l1、掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理 及其实验操作技术。l2、掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线 求样品溶液中待测物质含量的方法。原理原理 1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。1951年，Lowry对此法进行了改进，先在标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。原理原理l第一步：双缩脲反应第一步：双缩脲反应 在碱性溶液中,双缩脲(H2NOCNHCONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键,因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的碱性铜试剂中的CuCu2+2+作用生成紫红色的作用生成紫红色的蛋白质蛋白质-Cu-Cu2+2+复合物。复合物。原理原理l第二步：第二步：FolinFolin-酚显色反应酚显色反应 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸(Tyr)，故有此显色反应。即蛋白质蛋白质-Cu-Cu2+2+复合物复合物中所含的酪氨酸或中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成生成蓝色的化合物蓝色的化合物。在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。原理原理样品样品l健康人血清l正常人血清蛋白质含量：6080g/L试剂试剂l1、牛血清白蛋白标准液（200g/ml）l2、碱性硫酸铜溶液（当日有效）l3、Folin-酚试剂仪器和器材仪器和器材l1、V-1100分光光度计l2、恒温水浴箱l3、试管6支、试管架l4、加样枪、加样枪架l5、刻度吸管l6、坐标纸操作操作l各管混匀，室温放置各管混匀，室温放置10min。l向各管内加入向各管内加入Folin-酚试剂酚试剂0.20mL,2s内迅速混匀内迅速混匀！40放置放置10min。l冷却至室温后，以冷却至室温后，以500nm波长比色，用波长比色，用1号管号管作空白，读取各管吸光度。作空白，读取各管吸光度。试剂试剂 （ml)123456牛血清白蛋白牛血清白蛋白标标准液准液-0.200.400.600.80-样样品液（稀品液（稀释释300倍）倍）-0.50蒸蒸馏馏水水1.00.800.600.400.200.50碱性硫酸碱性硫酸铜铜2.02.02.02.02.02.0蛋白蛋白质浓质浓度（度（g/ml）04080120160？注意事项注意事项lFolin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。l故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必必须立即混匀须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。注意事项注意事项l因因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20mL FolinFolin-酚试剂酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20mL FolinFolin-酚试剂酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。水浴10min，流水冷却后，每1分钟拿出一管，测吸光值。蛋白样品蛋白样品碱性铜试剂碱性铜试剂混匀，混匀，放放10min加酚试剂加酚试剂2s混匀混匀水浴水浴10min放至放至室温室温比色比色数据处理数据处理测定次数各管A值2 3 4 5 6 待测样品管7123各管平均值绘制标准曲线绘制标准曲线l以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，用铅笔绘制标准曲线。吸光度A蛋白质浓度C（g/ml）0.20.40.6.4080120160计算计算l根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。l然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(g/ml)。l血清蛋白浓度(g/ml)=样品蛋白质浓度2300为什么？为什么？本方法的特点：本方法的特点：l优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍；2.操作简单，不需特殊仪器设备。l缺点：1.操作时间较长，要精确控制操作时间；2.标准曲线不是严格的直线形式；3.专一性较差，干扰物质较多。复习思考题复习思考题l1、试述Folin-酚试剂法的优点？l2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？请将答案附在实验报告上！