62EB病毒(EBV)核酸检测标准操作规程(荧光PCR法)1.docx

EB病毒EBV核酸检测标准操作规程荧光PCR法1. 目的标准EB病毒核酸DNA荧光PCR法检测操作流程，准确进展EB病毒DNA分析。2. 应用范围使用中山大学达安基因股份EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒荧光PCR法和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进展EB病毒DNA检测。3.职责由PCR试验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，试验室主管负责监视实施。4. 内容4.1 试验原理及其临床应用本试剂盒用一对EB病毒EBV特异性引物和一条EB病毒EBV特异性荧光探针，配以PCR反响液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体dNTPs等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒EBVDNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床供给参考，4.2 标本采集4.2.1 使用标本类型：全血。4.2.2 标本采集；由合作单位依据以下要求进展采集。4.2.2.1 全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠) 或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，马上轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。4.2.3 标本保存和运送：标本可马上用于测试，也可以保存于-20待测，保存期为6个月。标本运送承受0冰壶。4.3 试剂预备4.3.1 供给商：中山大学达安基因股份。4.3.2 此试验试剂应放在冰箱-20保存，在试验前5分钟取出备用，试验后应马上放回冰箱-20。4.3.3 假设试剂消灭了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应准时更换。4.4 质控品4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家供给。4.4.2 质控品保存条件：置于-20冰箱中保存。4.4.3 质控频度：每次试验均需做质控。4.5 操作过程说明4.5.1 DNA提取4.5.1.1 质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数秒，吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，参与50ulDNA提取液充分混匀，100恒温处理10±1分钟；12023 rpm离心5分钟，备用。4.5.1.2 样本处理4.5.1.2.1 取全血500ul至枯燥玻璃试管中，参与生理盐水500ul轻摇混匀；4.5.1.2.2 取枯燥玻璃试管参与1ml淋巴细胞分别液；4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢参与加有淋巴细胞分别液的试管中(留意沿着管壁， 速度要慢)；4.5.1.2.4 2023rpm离心20分钟建议用水平离心机；4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下其次层)，参与1.5ml离心管，12023rpm离心5分钟；4.5.1.2.6 去上清，沉淀中参与50ulDNA提取液充分混匀，100恒温处理10±1分钟；12023rpm离心5分钟，上清备用。4.5.2.1 加样：取PCR反响管假设干，参与处理后的样品标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。4.5.3 PCR扩增将预备好的PCR反响管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按以下循环参数进展扩增反响：37-2min；94-2min；94-15ses ；55-45ses ×40 cyclics ；EBV检测荧光素：FAM;反响体系：50ul； 荧光信号收集：55-45ses，末端收集。4.5.3 Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.3.1 翻开计算机电源。4.5.3.2 将Mx3000P电源开关翻开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。翻开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿色。假设不是绿色而是红色，软件会提示，这时只需要连续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进展的试验类型，通常选择第一项“Quantitive PCRMultiple Standards”进展确定定量分析。4.5.3.4 确定卤钨灯已经翻开。(绿色)则说明卤钨灯已经翻开；黄色则说明卤钨灯正在预热；红色则说明卤钨灯没有被翻开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源翻开。在卤钨灯已经被翻开的状况下，软件界面右下方会显示绿色。4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开头试验。4.5.3.6 在里，对所选孔进展设定，在Well type中设定Standard标准 品、NTC阴性比照、unkown样品等，并选择正确的荧光通道FAM, HEX, ROX，Cy5， 参比荧光Reference dye选None。对于标准品，在Well type中设定为“Standard” 后，再设定其模板浓度。方法为：点击 ，10倍的浓度梯度可以直接点击，在下拉菜单中选择不同的系数关系后，依次点击设定为标准品的另外几个孔，浓度将实时显示。也可以直接点击标准品的各个孔位， 在一栏，手工输入浓度。假设要对不同的样品进展编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。或者点击版面右上方的，导入以前使用的96孔板设定。4.5.3.7 点击，进展PCR循环的设定，可以直接点击温度、时间转变各项温度、时间、循环数等。在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，点击，或点击鼠标右键， 在弹出的对话框中，选择Add Segment，则可在该大步骤之后添加一个大步骤； 假设是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。假设要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。点击，导入以前设定的PCR程序。END代表在这一步完毕时采集荧光信号；ALL代表在这一步的全过程都采集荧光信号，一般用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。假设要去除，可将其拖出循环设定区域。4.5.3.8 完毕之后，点击软件界面右上方的。会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需 要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接点击“马上运行”， 但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。软件界面右下方会消灭运行状态显示框Run Status，点击Start开头试验。在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”，在PCR运行完毕之后软件将自动关闭卤钨灯。4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击，观看样品的实时扩增原始结果。4.5.3.10 PCR运行完毕后，点击，再点击Results，软件将自动进展结果分析，也可点击手动进展结果分析。可以手动调整阈值线拖动进展分析。点击可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。左下角的可选择相应的荧光观看扩增曲线。右边的可依据自己的需要选择显示的界面。是扩增曲线，Ct值列表，标准曲线，样本起始浓度，结果excel表格输出，合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。4.5.3.11 分析曲线时，假设曲线不够光滑，还能用中的Smoothing对曲线进展调整，一般Amplification average是3，可按需要将其调至较大数值，如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会略微靠后一点，使数据失真，通常状况下，不建议这么做。4.5.3.12 假设需要对每条曲线进展单独的基线设置，点击中的Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面对应的各孔，单独进展基线起始和终止位置的调整。4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次试验标准曲线的补充说明。点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择Multiple Experiment Analysis 多项试验结果分析选项， 点击“OK”，消灭如下对话框，建议选择“Use common threshold”进展分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文件，点击“Finish”即可。4.5.3.14 这里选择时要留意：1.两个或者多个试验结果要有一样的试验程序 ；2.每次程序中的循环数应当全都。在分析栏可以选择不同试验的不同反响孔进展同步分析。4.5.3.15 分析质控结果：阴性质控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。阳性质控品：EBVFAMCt值<33，且有较好的对数增长曲线。以上要求需在同一次试验中同时满足，否则本次试验无效，需重检测。4.5.3.16 记录试验数据。4.5.3.17 取出完毕后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管裂开而导致污染。4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析4.5.4.1 先翻开电脑，再翻开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，翻开仪器数据库。4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。4.5.4.3 在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。4.5.4.4 在弹出的界面中，点击“”，进入的试验设置界面：。4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。4.5.4.8 在“Programs”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性延长退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。4.5.4.9 在“Temperature Targets”下：通过“”“”来增加每个循环阶段里的小步骤，并在采集荧光的小步骤的“Acquisition Mode”里选择“single”，采集荧光。4.5.4.10 在“”菜单栏下，通过“”增加或者削减试验工程类型，通过右边的孔位选择， 设置不同工程的区域，然后点击“Apply”保存。4.5.4.11 在“”菜单栏下，Step 1处，选择“Abs Quant”；Step 2处，编辑标准品及样本。4.5.4.12 标准品设置：在Step 2下的96孔面板中，选中标准品反响孔，然后选择右侧的模板检测通道，如“483-533”，然后将下方孔位的“Quantification Sample Type” 选择为“Standard”，并在“Concentration”处输入其浓度即可。4.5.4.13 样本设置：类似于标准品设置，但仅需要编辑其“Sample Name”即可。4.5.4.14 返回“”菜单，在“”子菜单右下角点击“”，运行试验。4.5.4.15 试验完毕后，在“”菜单下，选择“Abs Quant/Fit Points”，进入结果分析界面：【Analysis】：在此菜单下对阈值线进展调整；【Noise Band】：对试验的信噪比进展调整；【Filter Comb】：对不同荧光通道进展选择；【Std Curve】：对定量参考品进展选择，包括试验中的参考品、导入的标准品等；4.5.4.16 在上述操作完成后，点击“”；在“”菜单中，依据需要选择报告中需包含的工程，然后得出结果。4.5.4.17 分析质控结果：阴性质控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。阳性质控品：EBVFAMCt值<33。以上要求需在同一次试验中同时满足，否则本次试验无效，需重检测。4.5.4.18 记录试验数据。4.5.4.20 取出完毕后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管裂开而导致污染。4.5.4.21 关闭扩增仪电源和计算机电源。4.6 结果判定EBV阳性：EBV-FAMCt36，且有较好的对数增长曲线。EBV阴性：EBV -FAMCt值=40或者“No Ct”(Mx3000P)或者“Undet.”(ABI 7500)。 EBv检测灰度区：EBV -FAM36<Ct样本<40，因试验存在系统及人为不确定性因素，应重复检验确认。4.7 参考值：阴性。4.8 留意事项4.8.1 PCR荧光定量检测法比较简洁受污染，所以试验过程中应尽量避开反复开盖，所用耗材均需高压灭菌。4.8.2 试剂使用前要完全解冻，但应避开反复冻融。4.8.3 试验完毕应用有效氯终浓度为2023mg/L的消毒液擦拭桌面，并翻开紫外线灯消毒。本作业指导书颁发部门: 质管部本作业指导书分发部门：PCR室本作业指导书编写人:编写日期：年月日本作业指导书审核人：审核日期：年月日本作业指导书审批人:执行日期：年月日