基因表达和检测-PPT.ppt

基因表达和检测 蛋白A是一个胞浆蛋白，刺激之后会转移到细胞核，怎么能实时观察它的入核呢？在组织里检测到蛋白A和蛋白B有相互作用，怎么能知道它们是否有直接的相互作用，以及决定它们相互作用的序列是哪一段？Questions一些基本的概念 基因(gene)是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因表达(geneexpression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。生物体内的各种功能蛋白质和酶都是相应的结构基因编码的。克隆(clone)，来源于希腊语Klon(嫩枝)。在园艺学上，克隆是指通过营养生殖产生的单一植株的后代，很多植物都是通过克隆这样的无性生殖方式从单一植株获得大量的子代个体。在广义上是指利用生物技术由无性生殖产生与原个体有完全相同基因组后代的过程。在生物学上，是指选择性地复制出一段DNA序列（分子克隆）、细胞（细胞克隆）或是个体（个体克隆）。基因克隆（geneclone）基因克隆是指在体外对DNA按照即定目的和方案进行人工重组,将重组DNA进行扩增以获得目的基因的大量拷贝。克隆基因表达的目的1)探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理2)克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构和功能的研究3)某些特定生物活性的蛋白质可以在宿主细胞中大量表达而获得，因此在医学上甚至工业都有很重要的应用价值。（胰岛素制备，生长激素等）基因克隆技术Paul.Berg1980 Nobel Price1972年把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，于是产生了一种新的重组DNA分子，从此产生了基因克隆技术。Walter Gilbert1980 Nobel PriceFrederick Sanger1980 Nobel Price1975年时，共同发展出一种称为链终止法（chainterminationmethod）的技术来测定DNA序列，主要是先进行PCR，利用DNA引物和DNA聚合酶使DNA链得以展开复制，再利用双去氧核苷酸（dideoxynucleotides）来终止DNA链的合成Stanely Cohen1986 Nobel Price1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌，第一次完整地建立起了基因克隆体系。细菌质粒（plasmid）Herbert W.Boyer发现细菌的基因可与真核生物基因结合。用转基因细菌人工合成了胰岛素，随后在1979年合成了生长激素。1976年与罗伯特斯旺森建立了基因泰克公司。1980年获拉斯克基础医学研究奖，1990年获国家科学奖章，2004年获邵逸夫奖。是一种细胞质遗传因子，是细菌细胞内独立于染色体外的一种复制子，它在细胞分裂时，能恒定地传给子代细胞，并能给细胞带来表观效应，但是它的消失并不影响细胞生存大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点 可以互相讨论下，但要小声点染色体与质粒 存在于染色体外（细菌的DNA除大部分集中于核质内）双链环形DNA 分子量远比染色体为小，仅为细菌染色体DNA的0.53%质粒亦可携带遗传信息，可决定细菌的一些生物学特性 质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质 质粒的传递（转移）是细菌遗传物质转移的一个重要方式。有些质粒本身即具有转移装置，如耐药性质粒（R质粒）；质粒可自行失去或经人工处理而消失。质粒可以独立复制 可有几种质粒同时共存在于一个细菌内1.质粒并非细菌生存所必不可少的遗传物质。细菌如失去染色体，则不能生存；然而细菌失去质粒后仍能生存。这是由于染色体DNA携带的基因所编码的产物，在细菌新陈代谢中是生存所必须者；而质粒携带的基因所编码的产物并非细菌的生存所必须者。因此质粒可以在细菌间传递与丢失。2.质粒的传递（转移）是细菌遗传物质转移的一个重要方式。有些质粒本身即具有转移装置，如耐药性质粒（R质粒）；而有些质粒本身无转移装置，需要通过媒介（如噬菌体）转移或随有转移装置的质粒一起转移。获得质粒的细菌可随之而获得一些生物学特性，如耐药性或产生细菌素的能力等。3.质粒可自行失去或经人工处理而消失。在细菌培养传代过程中，有些质粒可自行从宿主细菌中失去。这种丢失不像染色体突变发生率很低，而是较易发生。用紫外线、吖啶类染料及其他可以作用于DNA的物理、化学因子处理后，可以使一部分质粒消失，称为消除。目前学者们感兴趣的是如何通过人工处理消除耐药质粒或与致病性有关的质粒。4.质粒可以独立复制。质粒为DNA，有复制的能力，质粒的复制可不依赖于染色体，而在细菌胞浆内进行。这一特性在基因工程中需扩增质粒时很有用处，因可使细菌停止繁殖而质粒仍可继续复制，从而可获得大量的质粒。5.可有几种质粒同时共存在于一个细菌内。因质粒可独立复制，又能转移入细菌和自然失去，因此就有机会出现几种质粒的共存。但是并非任何质粒均可共存，因发现在有些情况下，两种以上的质粒能稳定地共存于一个菌体内，而有些质粒则不能共存。质粒基因克隆 基因克隆是70年代发展起来的一项具有革命性的研究技术，可概括为分、切、连、转、选。分是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；切是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；连是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；转是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；选则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因工程技术的两个最基本的特点是分子水平上的操作和细胞水平上的表达，而分子水平上的操作即是体外重组的过程，实际上是利用工具酶对DNA分子进行外科手术。播放视频分切、连转选1.如何寻找合适的载体/质粒？1）质粒的分类 2）质粒各个元件的识别2.如何扩增得到DNA片段1）PCR技术2）引物设计 3.如何将目的基因与载体连接？1）内切酶，连接酶2）连接反应4.如何将载体导入细胞或质粒？5.基因产物的检测基因克隆1.如何寻找合适的载体/质粒？1）质粒的命名2）质粒各个元件的识别3）质粒的分类1）质粒命名质粒载体的命名，首字母用小写p表示，后面是一些描述性的缩写，如:pBR322的字母代表研究者F.Bolivar和R.Rodriguez,而322是与研究者设计相关的数字编码。1.如何寻找合适的载体/质粒？1）质粒的命名2）质粒各个元件的识别*3）质粒的分类2)质粒的各个元件一个复制子（replicon）（DNA复制是从一个DNA复制起点开始，最终由这个起点起始的复制叉完成的片段。）几个克隆位点一个选择性标记复制子多克隆酶切位点(MCS multiple cloning site)选择性：选择标记基因和筛选标记基因选择标记基因抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。1氨苄青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene,ampr）2四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,tetr）3氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr,cat）4卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin/neomycinresistancegene,kanr,neor）5琥珀突变抑制基因supFamp R筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。1插入失活通过插入失活进行筛选的质粒主要有pBR322，该质粒具有四环素抗性基因（tetr）和氨苄青霉素抗性基因（ampr）两种抗性标记。当外源DNA片段插入tetr基因后，导致tetr基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性。这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。2-互补（-complementation）选择性：选择标记基因和筛选标记基因amp R筛选标记基因筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。1插入失活2-互补（-complementation）-互补(Alpha complementation)：噬菌体载体的基因间隔区插入E.coli的一段调节基因及lac Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为 半乳糖苷酶的片段。突变型lac-E.coli 可表达该酶的W片段（酶的C端）。单独存在的及W片段均无半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物，这就是所谓的-互补。选择性：选择标记基因和筛选标记基因选择性：蓝白斑筛选lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37 温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。1.如何寻找合适的载体/质粒？1）质粒的命名2）质粒各个元件的识别3）质粒的分类克隆载体表达载体转染受体细胞克隆载体（pBR322,pUC19）克隆载体主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力。容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制。这就要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点。容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。有容易被识别筛选的标志，当其进入宿主细胞、或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞都能容易被辨认和分离出来。这才用于克隆操作表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、SD序列、终止子等），是目的基因能够表达的载体。是否含有表达系统元件，即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。根据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中快速高效地表达、合成基因产物的体系。2真核表达系统 使外源基因在真核细胞中表达的体系。原核表达系统的重要调控元件：启动子 SD序列 终止子 原核表达系统的重要调控元件：启动子(promoter,P)启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列，没有启动子，基因就不能转录 一般长40-60bp，富含A-T碱基对 具有保守序列：-10区（pribnow box）：TATAAT-35区 SD序列 终止子 原核表达系统的重要调控元件：启动子 SD序列（Shine-Dalgarno）AUG上游3-11 bp 长约3-9bp mRNA与16s核糖体亚基间的识别与结合序列 终止子 SD序列与AUG之间的的距离,是影响mRNA转译成蛋白的重要因素之一原核表达系统的重要调控元件：启动子 SD序列 终止子（terminator，T）:位于基因3端,给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列 转录终止过程包括:1)RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进 2)完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来 3)RNA聚合酶从模板上释放出来表达载体根据受体细胞的不同可分为：1原核表达系统 将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中快速高效地表达、合成基因产物的体系。2真核表达系统使外源基因在真核细胞中表达的体系。主要由CMVp启动子、兔-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUCorigin能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。外源基因在原核细胞中的表达原核生物基因表达的特点:原核细胞缺乏真核细胞转录后的加工系统,同时原核细胞也缺乏真核细胞翻译后的加工系统1.原核生物只有1种RNA聚合酶2.原核生物的基因表达是以操纵子为单位的3.原核生物无核膜,转录和翻译是耦联的4.原核基因不含有内含子5.原核生物基因表达的控制主要是在转录水平，对RNA合成的调控有两种方式:起始控制和终止控制6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有SD序列真核表达系统的必要性及优势具转录后加工系统具翻译后修饰系统可实现真正的分泌表达基因治疗外源基因在真核系统中的表达From Molecular Cell Biology 4th ed1.如何寻找合适的载体/质粒？1）质粒的分类2）质粒各个元件的识别2.如何扩增得到DNA片段1）PCR技术2）引物设计 2.如何扩增得到DNA片段1）PCR技术2）引物设计PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产新的互补DNA片段。PCR由变性-退火-延伸三个本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94 左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。Kary Mullis1992 Nobel PricePCR聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）PCR克隆方法的主要优缺点优点：1）快速简单 2）高度敏感 3）样本适应范围大缺点：1）必须预先知道DNA序列信息 2）扩增片段大小有限 3）保真度(PCR聚合酶)PCR实验注意事项 1.所有缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。2.开始工作应戴上手套，并应勤于更换。3.准备专用的成套试剂，分装成小份。这些试剂不得用于其他用途。4.装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心（10秒）。这样可使液体沉积于管底，从而减少污染手套或加样器的机会是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等PCR相关技术 RT-PCR，逆转录PCR（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction）RT-PCR，逆转录PCR受多个因素影响，如硫酸镁的浓度,引物退火的温度，扩增的循环数等。建议选择0.5-3.0mM(相差0.5mM)的硫酸镁作初步实验。对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次优点：对目标序列的高特异性-阴性结果确定设计相对简单-与目标序列某一区域互补重复性比较好缺点：只适合一个特定的目标;委托公司标记，价格较高;不易找到本底低的探针RT-PCR，逆转录PCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析PCR相关技术 RT-PCR，实时荧光定量(real-timePCR)2.如何扩增得到DNA片段1）PCR技术 2）引物设计引物设计基本原则 引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）错误引发位点（falseprimingsite）阅读框1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，即Taq酶的最适温度2.产物的长度扩增片段长度为100600碱基对.3.Tm值引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.1退火温度=4(G+C)+2(A+T)-(58)4.引物的GC含量有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5.引物自身引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败SPBamHIpcDNA3.1NR1-1a任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1Plasmid 1:SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP 121 ggggctccta gagaacccgg gggcgcttga ccgcgcgcgg gcggcccgcg ggtcgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcactcgc gcaacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctcatgag 241 caccatgcac ctgctgacat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgccc gcgcGgATCC 301 cgaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agctcaacgc 421 cacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catctctagc caggtctacg ctatcctagt tagccacccg cctactccca acgaccactt 541 cactcccacc cctgtctcct acacagctgg cttctacaga atccctgtcc tgggactgac 601 tacccgaatg tccatctact ctgacaagag tatccacctg agtttccttc gcacggtgcc 661 gccctactcc caccagtcca gcgtctggtt tgagatgatg cgagtctaca actggaacca 721 catcatcctg ctggtcagcg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gcttggagac 781 gttgctggag gaacgggagt ccaaggcaga gaaggtgctg cagtttgacc caggaaccaa NR1的编码序列绿色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框 ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCCGC TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGTG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG CTGCTGCCTAC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG GACGAGCTGT ACAAGTAAGFP序列引物要求 PCR扩增GFP GFP两边添加BamHI酶切位点 保证NR1的阅读框不改变GFP序列：5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC GCATG GACGAGCTGTACAAGTAA 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG.CGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC GCATGGACGAGCTGTACAAGTAA 3 CGTACCTGCTCGACATGTTCATT 55 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG.CGTACCTGCTCGACATGTTCATT 5 Primer 1:5 GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCPrimer2:5ggatccttacttgtacagctcgtccatgcPrimer 1:5 GGATCCg ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCPrimer2:5ggatccGGttacttgtacagctcgtccatgc引物主体添加酶切位点注意阅读框Primer 1:5 ccgcGGATCCg ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCPrimer2:5ccgcggatccGGttacttgtacagctcgtccatgc添加保护序列，注意GC比值From Molecular Cell Biology 4th ed分切、连1.如何寻找合适的载体/质粒？1）质粒的分类2）质粒各个元件的识别2.如何扩增得到DNA片段1）PCR技术2）引物设计3.如何将目的基因与载体连接？内切酶，连接酶，碱性磷酸酶3.如何将目的基因与载体连接？1）内切酶2）碱基磷酸酶3）连接酶（restriction endonuclease）:一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。限制性内切酶命名：一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株（品系）。例如，从Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性内切酶称为Bam H，在同一品系细菌中得到的识别不同碱基顺序的几种不同特异性的酶，可以编成不同的号，如HindII、HindIII，HpaI、HpaII，MboI、MboI等。单位定义 在指明pH与37，在0.05mL反应混合物中，1小时消化1g的DNA的酶量为1单位5-G/AA*TTC-33-CCTA*A/G-5-酶切位点用“/”表示.-甲基化位点用*.Restriction-recognition sites are short DNA sequences recognized and cleaved by various restriction endonucleases 1）测试酶切DNA的量2）计算完全酶切所需的酶量。为使终体积中甘油的浓度低于8%，计算能加的酶量，最多能加终体积的10%（甘油的浓度为5%）。3）10X反应液的体积应为终体积的1/10；10X反应液的体积不应小于酶的体积。4）加入计算好的DNA，10X反应液，酶。5）加入水到终体积（20-50ul），轻轻混匀，在适当的温度下保温。一般酶的最适温度为37度，但有例外。应查讯分析说明。比如：质粒DNA（2ug/ul）5ul10X反应液5ul酶（5ug/ul）5uldH2O35ul50ul37度保温2-3小时。单酶切流程双酶切流程1.一次使用两个限制性内切酶的一般步骤，如同使用一个限制性内切酶的一般步骤。2.注意两个限制性内切酶在同一种缓冲液中都要有活力。甘油的浓度不应超过终体积的8%。3.选择合适的缓冲液3.如何将目的基因与载体连接？1）内切酶2）碱基磷酸酶（alkalinephosphatase）碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。3）连接酶Alkaline Phosphatase2Pi碱性磷酸酶LigaseNo ReactionPOHPOHVector DNAInsert DNAOHOHPPLigaseOHOHOHOHTransformation(bugs grow)NickNick3.如何将目的基因与载体连接？1）内切酶2）碱基磷酸酶（alkalinephosphatase）3）连接酶DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键 平末端连接-效率低-仍然可以使用T4噬菌体连接酶.-需要高浓度的DNA-一般只能连接3-4kd.From Molecular Cell Biology 4th ed分切、连转1.如何寻找合适的载体/质粒？1）质粒的分类2）质粒各个元件的识别2.如何扩增得到DNA片段1）PCR技术2）引物设计3.如何将目的基因与载体连接？1）内切酶，连接酶2）连接反应4.如何将载体导入细胞或细菌？4.如何将载体导入细胞或细菌导入细菌1）感受态细菌2）CaCl2转化法3）电转化法导入哺乳细胞磷酸钙转染法脂质体介导的转染电穿孔转染法以病毒为载体指经过适当处理后容易接受外来DNA进入的细胞。如大肠杆菌经CaCl2处理，成为容易受质粒DNA转化的细胞。一般来说,感受态细胞的最基本要求是：1、没有质粒2、容易被转进去（一般是G-细菌，细胞壁薄）3、营养条件一般，非苛养菌制备感受态细胞时,测OD600在0.3-0.5之间，空白用无菌体的LB培养基。1)感受态的感受效率最关键的是一个冷字，刚制备的感受态其感受效果最好，但是随着时间的延长感受效果会逐渐下降，所以要将制好的感受态细胞冻存于液氮中，或-70度冰箱保存，这样感受效果才不至下降过快。2)一般感受态制备好以后小时其转化效率最高，随后就逐渐下降。3)一般的宿主菌都不要传代太多，传多了就容易状态不好和污染杂菌。4)状态好的时候建议冻上一批，用EP管分装好，然后，每次就可以取冻存的菌种来扩增使用。1）感受态细菌2）氯化钙转化1.氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）的通透性；2.热激后迅速转移到冰上：促使质粒DNA转移进入胞内；3.这种转化方法适用于双链环状DNA（质粒），线型DNA不能采用此法。（在自然界自然发生的转化过程中，进入细菌细胞中的为单链DNA。）4.如何将载体导入细胞或细菌导入细菌（感受态细菌）CaCl2转化法电转化法导入哺乳细胞（瞬时转染和稳定转染）瞬时转染：在DNA导入后1-4天内进行分析1）磷酸钙转染法2）脂质体介导的转染3）电穿孔转染法4）病毒载体5）DEAE-葡聚糖转染法稳定转染这几种方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暂时性转染和永久性转染。但它们有各自适用的细胞系。培养的细胞不同，其在摄取和表达外源DNA的能力上可能存在几个数量级的差异。因此针对细胞系优化并比较几种不同方法的效率很重要1）磷酸钙转染法核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA仅有1%5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法2)脂质体介导DNA 转染法脂质体(lipofectinregeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-1-2，3-Dioleyoxy,Propyl-n,n,n-TrimethylammoniumChloride(DOTMA)和Dioleoylphotidye-thanolamine(DOPE)的混合物1:1(w/w)。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不超过24小时为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。3)活体电穿孔法(in vivo electroporation)是将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的微小通道105115m,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。在此期间生物大分子如DNA可通过这种微小的通道进入细胞。胚胎电转化新生鼠电转化4）病毒载体转染常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和慢病毒。逆转录病毒载体只能感染分裂期细胞，而且容量有限。腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬时感染。慢病毒（LV）具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。慢病毒不产生任何有效的细胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能持续数月，且无可观察到的病理学现象5)DEAE-葡聚糖转染法DEAE-葡聚糖介导的转染，其原理还不清楚，可能是通过内吞噬作用而使DNA转导进入细胞核，此法只适合暂时转染实验，转染效率与DEAE-葡聚糖浓度以及细胞与DNA/DEAE-葡聚糖混合液接触时间的长短很有关系，可采用较高浓度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用较短时间(30分钟-1.5小时)，又可用较低浓度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用较长时间(8小时)。转染方法 原理 主要应用 特点 DEAE 带正电的 瞬时转染 相对简便、重复比磷酸钙好，但对细胞有一定的毒副作用，转染时需除血清且一般只用于 磷酸钙法 磷酸钙 稳定转染，染瞬转染 不适用于原代细胞（所需的细胞建议用 阳离子脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物，然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合；另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞。稳定转染，瞬时转染，所有细胞 使用方法简单，可携带大片段 阳离子聚合物 带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用，并通过内吞作用进入细胞。稳定转染，瞬时转染，所有细胞 除了具有阳离子脂质体的转染效率高，操作简单，适用范围广，重复性好等特点外，还具有在体内，转染效率高，细胞毒性低等特点，是新一代的转染试剂。病毒介导法 逆转录病毒 通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞，之后反转入酶启动合成 稳定转染，特定宿主细胞 可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等，但携带基因不能太大（腺病毒 先和细胞表面的受体结合，继而在 瞬时转染，特定宿主细胞 可用于难转染的细胞，需考虑安全因素 Biolistic 将 瞬时性转染，稳定转染 可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞 显微注射法 用显微操作将 稳定转染，瞬时转染 转染细胞数有限，多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 电穿孔法 高脉冲电压破坏细胞膜电位，稳定转染，瞬时转染，所有细胞 适用性广，除了质粒外，还可转染大的基因组（外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。G418是一种氨基糖类抗生素其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达使细胞获得抗性而能在含有418的选择性培养基中生长。418的这一选择特性已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。稳定转染-新霉素筛选From Molecular Cell Biology 4th ed分切、连转选1.如何寻找合适的载体/质粒？1）质粒的分类2）质粒各个元件的识别2.如何扩增得到DNA片段1）PCR技术2）引物设计3.如何将目的基因与载体连接？1）内切酶，连接酶2）连接