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    :自身抗体检测的规范化及实践.docx

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    :自身抗体检测的规范化及实践.docx

    最新:自身抗体检测的规范化及实践摘要随着自身抗体检测的临床推广应用,对自身抗体检测的标准化和规范化显 得尤为重要。由于自身抗体检测的复杂性和特殊性,标准化往往难以完全 实现并遇到诸多挑战,而规范化切实可行且不断被重视,但其涉及到自身 抗体检测的各个过程、多个方面。鉴于此,结合国内外近年来发布的相关 自身抗体检测的临床应用共识及其实践,探讨自身抗体检测的规范化。自身免疫病(autoimmune disease , AID )是机体自身免疫异常引起的 一类异质性疾病,包括器官特异性AID和系统性AID。AID的临床表现具 有广泛性、复杂性。尤其是系统性AID可累及机体各部位,几乎可涉及各 临床专科,给临床诊疗带来困难。因此,临床上需要对相关的生物标志物 进行检测,而自身抗体作为AID最具有特征性的生物标志物,对AID的 诊断、风险评估、预后及疾病管理等具有重要的临床意义口】。目前,随着自身抗体检测的临床应用越来越广泛,如何制定自身抗体检测 的标准化和规范化显得尤为重要。由于自身抗体检测的复杂性和特殊性, 标准化往往难以完全实现并遇到诸多挑战,而规范化切实可行且不断被重 视,但其涉及到自身抗体检测的各个过程、多个方面乙3 。对此,现结合 国内外近年来发布的相关自身抗体检测的临床应用共识及其实践,探讨自 身抗体检测的规范化。(至少1周)后采集血液标本。血液标本采集后应及时进行离心,以确保 离心后血浆中的血小板计数小于10x109/L ,确保凝血因子活性。LA混合 试验(循环抗凝指数)和确证试验(纠正百分比、标准化比值)的检测结 果,建议采用待测患者血浆与正常血浆的比值来表示,LA的检测结果除 上述比值外,亦应有阴性、阳性的结果判断。建议使用非参数的百分位数 方法建立截止值,推荐采用99的百分位数(99% ),大于截止值判断为 阳性。aCL抗体、抗02Gp I抗体的检测,使用血清标本,避免热灭活和反复冻 融、溶血及脂血标本。通常检测aCL抗体、抗02Gpi抗体的IgG和IgM 亚型,若结果阴性但临床疑诊APS时,进一步检测IgA亚型。aCL抗体 检测的靶抗原应包括心磷脂和B2Gp I ,抗02Gp I抗体检测的靶抗原应采 用包括全部氨基酸序列区域(结构域I V )的人源性52Gp I。检测方法 有ELISA、化学发光法(CLIA )等,自动化、定量检测是今后发展的必然 趋势。检测结果采用国际单位,可促进检测结果在不同实验室、方法学间 的一致性和可比性。使用多点定标,定标值与其预计值的相关系数应大于 或等于0.90。检测结果变异系数(CV )应小于或等于10% , 20%为最大 可接受值。每批次检测时,建议使用阴性和阳性质控物进行质控,阳性质 控至少要包括检测值接近截止值的质控物。定性检测使用非参数的百分位 数方法建立截止值,推荐采用99的百分位数(99% );定量检测可参照 相关要求(如美国临床和实验室标准协会制定的EP28-a3c )建立,验证 参考区间。检测结果报告中应包括检测方法、检测结果及单位。aCL抗体、抗02Gp I抗体的中高滴度检测结果通常为99的百分位数(99% )的2倍 以上。aPLs阳性不仅见于APS患者,亦可出现在其他AID、恶性肿瘤、感染性 疾病、某些药物使用后及部分健康人群。接受华法林、肝素及新型口服抗 凝剂治疗的患者可能出现LA假阳性,因此对其的LA检测结果,应谨慎解 读。aCL抗体、抗02Gpi抗体检测通常包括IgG、IgM、IgA型。aCL-IgA 型、抗02Gp I -IgA型目前尚未纳入APS分类标准,单独aCL-IgA型、 抗02Gp I -IgA型中高滴度阳性较少出现,确切的临床意义仍有待深入研 究。aPLs低滴度阳性可见于生理性、暂时性、感染或病理状态,需结合患 者临床表现,并定期检测随访。新型aPLs检测项目的相关临床意义仍有 待在长期、前瞻性的研究及临床实践中深入探讨。4 .类风湿关节炎(RA )相关自身抗体检测的规范化27 : ra相关自身抗体,根据抗原的特性主要包括类风湿因子(RF )、抗瓜氨酸类蛋白抗体(ACPA )及其他自身抗体,其中RF和ACPA已纳入RA的分类标准,主 要用于RA筛查及诊断,同样在RA预后与治疗中起重要作用。RA相关自身抗体的实验室检测,通常使用血清标本,RF以检测IgM型 为主,ACPA以检测IgG型为主,针对不同的自身抗体可采用多种检测方 法。RF、抗环瓜氨酸肽(CCP )抗体检测结果使用国际单位(IU ),实验 室应参考试剂盒说明书上明确标示的性能参数进行验证。每批次定性检测 时,建议使用阴性和阳性质控品进行质控;定量检测时应至少选择两个水 平的室内质控品,一般情况下选择质控品的浓度应包括正常值(参考区间 内)和临床异常值。定性检测使用非参数的百分位数方法建立截止值,推 荐采用95的百分位数(95% ),大于截止值判断为阳性;定量检测以表 观健康人群的血清标本建立参考区间,对试剂盒厂家的参考区间进行验证。 定性检测结果报告应包括检测方法、检测结果(阴性/阳性)、滴度、参考 值及必要的临床建议;定量检测结果报告中应包括检测方法、检测结果、 单位、参考值及必要的临床建议。RF、ACPA作为RA分类标准中的实验室指标,在RA早期诊断中具有重 要意义,并可作为关节损害进展的预测因素,联合检测可提高RA诊断的 敏感度。RF检测以IgM型为主,但不同亚型的检测具有不同的临床应用 价值。对RA相关自身抗体进行定量检测,通常定量结果越高,临床意义 越大。虽然RF、ACPA已有标准物质,但由于不同厂家试剂针对的抗原表 位、抗原固定方法及检测技术等不同,不同厂家的检测结果有所差别。因 此,对RA患者病情监测时,建议选择同一厂家的定量检测试剂进行动态 观察。RF、ACPA阳性亦可见于其他AID,阳性结果不能独立作为确诊的 依据,而应根据相关临床诊治指南,结合患者关节炎的临床特点、影像学 及实验室检测结果进行诊断。5 . AILD相关自身抗体检测的规范化28:包括自身免疫性肝炎(AIH ) 相关自身抗体、原发性胆汁性胆管炎(PBC )相关自身抗体及原发性硬化 性胆管炎(PSC)相关自身抗体等。主要用于疾病的诊断与分类,亦有助 于重叠综合征的诊断。对肝功能异常、未明原因的肝胆疾病患者,检测 AILD相关自身抗体。自身抗体可在AILD患者出现典型临床症状前检测到, 对相关疾病具有预测价值。AILD相关自身抗体检测可采用以各种细胞、组织为实验基质的IIF,不同 的自身抗体在不同的实验基质上呈现不同的荧光模型。HF检测AILD相关 自身抗体的准确性与试剂、设备、实验人员操作和结果判读等因素有关, 应具有完善可靠的室内质控(包括阴性、阳性)和室间质评,确保实验检 测结果的重复性与准确性。其他免疫学方法具有实验操作简单、快速、易 自动化、定量或半定量检测的特点,但仅针对靶抗原明确的自身抗体,具 有一定的局限性。另外,不同试剂若采用不同来源的靶抗原,将产生不同 的临床诊断性能。AILD相关自身抗体具有不同的临床意义,不仅存在于AILD患者中,亦可 出现在AILD无症状者的临床前期,以及病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒 精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝癌及非肝脏疾病等患者中。另外,由 于自身抗体滴度较低,检测试剂包被抗原、方法学的差异,存在诊断标准、 分类标准以外的自身抗体等,故自身抗体阴性不能排除AILD。AILD相关 自身抗体在儿童患者中,其滴度可与疾病活动性、疗效监测等存在一定的 相关性,但在成人患者中不能作为上述的监测指标。在重叠综合征患者, 随病情的进展逐渐出现AILD相关自身抗体。总之,随着自身抗体检测的技术进步及其临床应用推广,为提高自身抗体 的规范检测,确保检测结果的正确解读,减少不必要的重复检测,降低患 者医疗费用,对自身抗体检测的临床应用规范化显得尤为迫切。目前,自 身抗体的检测已不断规范化,但仍需将规范化的建议、共识不断更新及临 床推广应用。、自身抗体检测临床应用存在的主要问题随着自身抗体的临床推广应用,自身抗体检测的标准化和规范化成为AID 实验诊断领域的主要问题。在自身抗体检测的实践中,存在不同实验室、 技术方法、生产厂家及批次间检测结果的不一致。若某些自身抗体检测结 果量值的改变,作为疾病活动度、预后评估等监测指标,检测结果的不一 致可能会对患者的临床决策产生影响。在临床研究、调查分析中亦发现,自身抗体检测结果存在不一致。一项在 临床药物试验的103例系统性红斑狼疮患者中检测抗核抗体(AN A ), 采用间接免疫荧光法(IIF )、酶联免疫吸附试验(ELISA )、基于微球的 多重检测方法(bead-based multiplex assay ),其中IIF采用了 3个不 同厂家生产的检测试剂,结果显示,不同检测方法、检测试剂其ANA的 检测结果不同。欧洲|自身免疫标准化促进会(EASI)对12个欧洲国 家、1 200个实验室的ANA及其特异性自身抗体的检测方法、结果解释 及检测程序进行调查,结果显示JIF检测ANA的滴度、荧光模型、ANA 相关特异性自身抗体的检测方法、抗双链DNA抗体的检测方法和报告、 ANA检测程序,在不同国家甚至同一国家不同实验室间存在差异5 。对 此,2014年EASI和自身抗体标准化委员会(ASC)共同发表了 25条"抗 核抗体检测的国际建议"6,目的在于规范ANA及其特异性自身抗体的 检测及临床意义。另外,由EASI组织的12个国家429个实验室,调查 抗中性粒细胞胞质抗侬ANCA的检测 结果显示 不同实验室间对ANCA 检测情况有较大的差别,如HF检测ANCA使用不同的实验室基质,其中77.9%的实验室使用乙醇固定的中性粒细胞,66.2%的实验室使用甲醛固 定的中性粒细胞。抗髓过氧化物酶(MPO )抗体、抗蛋白酶3 ( PR3 )抗 体使用不同的检测方法即使ANCA检测程序遵循国际共识亦存在差异7 o 在国内,由国家风湿病中心(CRDC)组织的关于IIF检测ANCA荧光模 型的判断网络调查发现,ANCA定性结果及荧光模型的判读存在明显差异。 一项采用12种不同检测方法、检测试剂,对国内肉芽肿性多血管炎(GPA ) 和显微镜下多血管炎(MPA )患者进行ANCA检测的多中心研究评估显 示,ANCA的不同检测方法、试剂存在不同的临床诊断性能8。对此, 2019年中国免疫学会临床免疫学分会发表了关于“抗中性粒细胞胞浆抗体 检测方法在诊断肉芽肿性多血管炎和显微镜下多血管炎中应用的专家共 识”,目的在于规范ANCA的检测方法,从而为临床提供准确的ANCA检 测结果9此外 其他自身抗体检测的临床研究、调查分析亦显示【1。,”, 12 , 在不同的实验室采用不同的检测程序、不同的检测方法,对检测结果存在 不同的解读及不同的检测截止值(cut off ;阳性判断值)设置。目前,自 身抗体检测主要存在标准化和规范化缺失的问题。自身抗体检测的标准化、规范化现状在实验诊断领域,标准化(standardisation )和规范化(harmonisation )2,13,14。见这两个术语经常被相互使用,用来定义实验室结果在不同测量方法(条件) 下具有的可比性,但基于溯源性原则有着不同的定义和要求1 表1。表1自身抗体检测的标准化和规范化的定义与要求项目标准化 使用标准质,以最大BS®rE兼容啕给果,最终获得一致隆果规范化侬入同测量方法、程序之间的差异,使X一或兼容(1)需要标准帔质、国际公认的检海B果单位(3)确保不同的方法学获得相同的检测结果(4 ) 8腔标准防费的组成,以俣证标准物质的更换(1)限措表现选择检测项目,萼要达成共识(2)检测程序达成共识(3 )侬方曲完E的怆贝蜡果报告达成共识(4 )实验室与球的有效沟通,以合理电解程怆贝第果对自身抗体检测的标准化,首先需要具有同质性、稳定性的标准物质。虽 然有ASC、世界卫生组织(WHO )、参考物质和测量研究所(IRMM ) 等多个国际组织在推动自身抗体标准物质的研制,但由于其来源所限,目 前仅有近30种常见的自身抗体标准物质。其主要来源包括:单一患者血 液标本,不具有广泛的代表性,目来源有限。如1985年由WHO赋值为 200IU,来源于一位系统性红斑狼疮患者的抗双链DNA抗体标准物质(编 码Wo/80 ) 0此标准物质目前已经使用完,最近制备新的参考物质(标 定值10OU/ampoule ,编码15/174 ),但与Wo/80无相关性,对抗双 链DNA抗体检测起校准作用” 。多个患者的混合血清标本,存在免疫 学检测的干扰物质(如类风湿因子等),可采用亲和纯化方法制备可去除 干扰物质。可针对多个抗原表位,提高各种自身抗体检测方法学间的可比 性。另外,单克隆细胞培养的自身抗体标准物质,具有均一性,且不含有 干扰物质,但不能代表患者来源的自身抗体特性。目前即使有自身抗体标 准物质,但由于自身抗体自身不同的亲合力(高亲合力、低亲合力)s亚 型(IgG、IgM、IgA等)、糖基化修饰等特征,针对不同的抗原表位(线 性表位、空间构象表位),不同检测的方法学具有不同的性能特征,以及 不同的生产工艺等,仍存在检测结果的不一致2,16 。另外,自身抗体检 测结果的国际单位较难进行验证获得,缺少标准方法作为参考。因此,自身抗体检测的标准化难以完全实现,相关自身抗体检测行业学会、组织已从标准化聚焦于规范化进程自身抗体检测的规范化,在实验诊断领域中已经不断被强调,不仅包括传 统的临床化学检验领域,亦应包括实验医学的其他领域,如临床免疫、临 床血液、临床分子、临床微生物检验等。不仅强调检验中的规范化,亦包 括检验前、检验后等检验全过程的规范化。为确保不同测量方法(条件) 下,检测结果具有的可比性,规范化的目的在于对正确的患者在正确的时 间选择正确的检测项目,以正确的形式提供正确的检测结果,提供正确的 解释及正确的建议18 。为实现自身抗体检测的规范化,可通过已达成的 自身抗体检测专家建议、共识及指南等形式,结合医学实验室质量和能力 认可准则(£015189)等实验室体系-9 ,进行自身抗体检测检验前的 项目选择、患者准备、标本运送,检验中的检测方法、检测程序、结果报 告、质量保证,检验后的结果解读、临床建议等规范。自身抗体检测规范 化的基本特征,见表20表2自身抗体检测规范化的基本特征项目要求参与者隆(1)限据惠智临床表现,结合朋分类、诊断及诊疗标港,参考自身抗体检测的后床应用范茎,选择造亘的自身抗体检酒项目临床医生、实蛉宣人员、护理人员、工勤前(2)患的识申请人员等(3)辟统 运隆 中(1)方法学的邮、龄正确认(2 )检监结果报告:内容、单位、参考区间实睑室人员、制造商技术人员等(3 )桧脸结果的质量俣证:质朝品、实验室间t用及检差结果的可比性后(1)检险结果鸵瓶告、发布(2)临床急义的触(裸时)造室人员、1加床医生(3)为械目三,自身抗体检测的规范化实践1. ANA检测的规越化"o.21,22 : ANA是临床应用中最为常见的一类自身抗体,以真核细胞的各种成分为靶抗原的自身抗体总称。ANA的临床 应用于疑似AID患者,特别是多器官受累的系统性(非器官特异性)AID 患者,检测ANA及其针对靶抗原的特异性自身抗体;以及高危人群的健 康体检筛查,如育龄期女性、AID患者的直系亲属、处于易诱发AID的环 境及免疫功能异常者等。以HEp-2细胞为实验基质的IIF,是检测ANA的参考方法和首选方法, HEp-2细胞在实验基质中显微镜下每视野(放大倍数为200倍)应可见 35个有丝分裂细胞;二抗应使用荧光素标记的抗人IgG抗体;IIF检测 ANA的稀释方法可根据不同的检测试剂而采用倍比稀释系统或,m稀释 系统。ANA特异性自身抗体可采用多种免疫学方法检测,不同的方法具 有不同的临床应用优缺点。其中抗双链DNA抗体检测使用绿蝇短膜虫为 实验基质的IIF、ELISA和放射免疫法(Farr法),若其他方法检测抗双链 DNA抗体阳性与临床表现不符时,建议采用IIF或Farr法进一步确认。 对SLE的疾病活动性进行监测时,应定期使用同种定量检测方法进行抗双 链DNA抗体的检测。在ANA检测中,可先用IIF进行ANA检测,若结 果阳性,需进一步行ANA针对靶抗原的特异性自身抗体检测。当临床高 度疑诊时,不论ANA总抗体的检测结果如何,均需要针对靶抗原的特异 性自身抗体进行检测。IIF-ANA荧光模型分为3类:细胞核荧光模型、细胞质荧光模型和细胞有 丝分裂荧光模型。为确保准确识别具有重要临床意义的荧光模型,以及荧 光模型判读难易程度不同,将ANA荧光模型分为必报荧光模型(基础级) 和选报荧光模型(疑难级)。IIF-ANA检测结果报告应包括:检测方法、 定性结果(阳性/阴性)、荧光模型、滴度及必要的临床建议。对混合荧光 模型,荧光模型的报告优先级顺序为细胞核荧光模型、细胞质荧光模型、 细胞有丝分裂期荧光模型。相同优先级的荧光模型,建议按滴度高低顺序 依次报告。IIF-ANA检测结果判读及报告人员应进行培训、考核及定期进 行结果判读比对。采用ELISA等其他检测方法的ANA检测结果,应包括 检测结果的定量数值和单位、参考区间及必要的临床建议。ANA针对靶 抗原的特异性自身抗体检测结果报告应包括,检测方法、定性结果(若为 定量检测方法应包含定量数值和单位)及参考区间,同时应包括必要的临 床建议。荧光模型对进行下一步针对靶抗原的特异性自身抗体的检测具有一定的 指导意义,但并非完全一致,不能仅从荧光模型来推断针对靶抗原的特异 性自身抗体或AID。不推荐使用ANA滴度(量值)的变化来反映AID的 活动性及疗效反应性。不同厂家试剂可采用不同的滴度(量值)系统,不 能直接进行滴度值的比较,但部分可溯源到国际单位(IU )后才能进行比 较。ANA针对靶抗原的特异性自身抗体对AID的诊断与鉴别诊断、病情 监测与疗效观察、病程转归与预后判断及疾病预警等方面具有重要的临床 意义。2. ANCA检测的规范化9,23, 24, 25 : ANCA是以中性粒细胞及单核细胞胞质成分为靶抗原的自身抗体,作为小血管炎的生物标志物,主要存在于ANCA相关血管炎AAV的患者中 对临床疑似AAV的患者检测ANCA。ANCA检测亦可用于非AAV的AID,如炎症性肠病、自身免疫性肝病 (AILD )、抗肾小球基底膜病等其他AID,特发性间质性肺炎、淋巴瘤、 药物诱导性血管炎及感染性疾病等其他疾病。以乙醇和甲醛固定的人中性粒细胞为实验基质的IIF检测ANCA ,血清标 本的稀释方法可根据不同的检测试剂而采用倍比稀释系统或/*稀释系 统,所用二抗应使用荧光素标记的抗人IgG抗体。实验室进行ANCA检 测时应有完善可靠的室内质控和室间质评体系,HF检测ANCA的室内质 控应包括胞质型ANCA ( cANCA )、核周型ANCA ( pANCA )的阳性和 阴性质控品。抗MPO抗体和抗PR3抗体可采用多种免疫学方法检测,应 注意不同检测方法临床应用的优缺点。定量检测抗MPO抗体和抗PR3抗 体,对患者病情监测时建议选择同一厂家的定量检测试剂动态观察。临床 疑似AAV患者,采用IIF-ANCA联合抗MPO抗体、抗PR3抗体检测。 而对于初诊的临床疑似MPA、GPA、嗜酸性肉芽肿性多血管炎(EGPA ) 患者,以及抗肾小球基底膜病、特发性间质性肺炎、伴随肾炎的感染性心 内膜炎可使用高敏感性和高特异性的抗MPO抗体、抗PR3抗体检测方法 进行检测。若检测结果阴性,但临床仍高度怀疑小血管炎,应使用其他免 疫学方法和/或HF-ANCA进行重复检测。对其他ANCA相关疾病患者, 建议在IIF-ANCA检测结果阳性后,再针对各种靶抗原的ANCA特异性自 身抗体进行检测。IIF-ANCA荧光模型分为cANCA、pANCA及不典型ANCA (不典型 cANCA和不典型pANCA )。cANCA和pANCA为必报荧光模型,不典 型ANCA为选报荧光模型。IIF-ANCA检测结果判读及报告人员应进行培 训I、考核及定期进行结果判读比对。IIF-ANCA检测报告内容应包括,检 测方法、定性结果(阳性/阴性)、荧光模型、滴度、参考区间及必要的临 床建议。ANCA特异性自身抗体(如抗MPO抗体、抗PR3抗体)的检测 报告内容应包括,检测方法、结果(若为定量检测方法应包含定量数值和 单位)、参考区间及必要的临床建议。cANCA、pANCA结合抗PR3抗 体、抗MPO抗体有助于AAV诊断,但不能仅凭此结果进行确诊,需结 合临床与相关实验室检测结果综合判断。不典型ANCA可出现在其他AID、 感染性疾病、肿瘤及药物使用后等。3.抗磷脂抗体(aPLs )检测的规范化26 : aPLs是一组以磷脂和/或磷脂 结合蛋白为靶抗原的自身抗体总称。根据靶抗原的特性主要分为狼疮抗凝 物(LA )、抗负电荷磷脂抗体、抗中性磷脂抗体、抗两性磷脂抗体、抗磷 脂结合蛋白抗体。其中LA、抗心磷脂(aCL )-IgG型抗体、aCL-IgM型 抗体、抗体糖蛋白I ( B2Gp I ) -IgG型抗体、抗02Gp I -IgM型抗体已 作为国际血栓与止血学会(ISTH ) 2006年修订的抗磷脂综合征(APS ) 分类标准中的实验室指标,应用于APS筛查与诊断。另外,aPLs检测亦 可用于血栓及病理妊娠的风险评估。LA的检测方法包括筛查试验、混合试验、确证试验,检测程序为筛查试 验T确证试验T混合试验,当筛查试验和确证试验检测结果难以解释时再 进行混合试验。LA的检测应在使用抗凝药物前或抗凝药物停用足够时间

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