实验技术路线-PPT.ppt

技术路线大家好 1双光子激光建立斑马鱼脊髓损伤模型的探索：明场下对脊髓定位，利用双光子强激光对脊髓进行深度扫描切割损伤5 小时后通过行为学软件分析损伤后的运动能力，判断损伤程度对损伤后的斑马鱼进行解剖，观察扫描处的脊髓及周围组织的损伤情况14dpf 幼年斑马鱼0.033%MS222 麻醉同时在损伤位点以下2mm 注射反向示踪剂生物胞素12 小时后做纵切切片，利用生物胞素抗体做免疫染色判断损伤的位置与大小是否与符合判断胶质斑痕的位置与大小是否符合12 小时后做纵切切片，利用GAFP 抗体和纤连蛋白抗体做免疫染色大家好 2前期实验：手术建模：手术组（n=68）假手术组（n=68）建模成功性分析：每周分析术后运动能力，连续跟踪7 周基因芯片分析：提总RNA分析全部基因的表达水平，统计分析各个基因表达变化定量PCR：提总RNA反转录检测sema4e和plxnd1 相对内参GADPH 表达水平的变化原位杂交：制作切片制作探针检测sema4e 和plxnd1 mRNA 的表达水平变化及表达细胞Westen Bolt：提总蛋白检测sema4e和plxnd1 蛋白表达水平的变化取脊髓（损伤位点以下1cm）：术后4hour,12hour,6day,11day 组大家好 3sema4e 与plxnd1 关系研究：sema4e 活性片段DNA 的扩增sema4e 特异性肽段的设计与合成sema4e 表达载体的构建表达载体的导入转染细胞的筛选与培养表达蛋白的提取表达蛋白的活性检测sema4e 免疫磁珠的制作sema4e 与plxnd1免疫共沉淀噬菌体展示技术淘选抗体ELISA 检测抗体活性ELISA 检测抗体专一性sema4e 与plxnd1免疫共定位大家好 4sema4e 与plxnd1 在斑马鱼脊髓损伤修复中的作用研究：大家好 5前期结果大家好 6Before lesionRed:sham operation(n=10)Blue:operation(n=10)图1：斑马鱼脊髓损伤后的运动能力的变化大家好Real time PCRtime pointschange folds大家好 810X 10X 10X 10X 10Xanti-sense probes sham 4hour 12hour 11day10X 10X 10Xanti-sense probes sham 4hour 12hour 11daysema4e:plxnd1:10X10X大家好 9通过双光子显微镜活体观察斑马鱼脊髓内的血管大家好 10plxnd1 在血管内皮细胞上表达10X 20X大家好 11结束大家好 12