2023年单克隆抗体制备实验过程.pdf
单克隆抗体制备实验过程 一、免疫动物 免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏 B淋巴细胞的过程。一般选用 6-8 周龄雌性 Balb/c 小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应 B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏 B淋巴细胞。说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为 IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。PS：1、一般皮下注射每个注射点注射 30-50ul 左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射 6-8 个点为宜。2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。3、冲击免疫完成后，应在 96 小时内完成细胞融合，否则相应的 B细胞数量会下降到未冲击前的水平。二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。（2）免疫小鼠脾细胞悬液 取 3 天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于 75酒精中 35min。无菌操作取出脾脏，置入盛有 5ml 不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有 5ml 不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成 35 个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至 50ml 离心管中，加不完全培养液 50ml，1000r/min 离心 5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于 10ml 不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得 0.5 2108 个脾细胞。（3）饲养细胞 将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射 10ml 不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部 1 分钟，随后吸出注入的培养液。1000r/min离心 5-10 分钟，弃上清。先用 5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加 HAT培养基，使细胞浓度为 2105/ml，备用。（4）主要试剂的配制 细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有 RPMI-1640或 DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4保存。不完全 RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液 96ml 100L.G.溶液 1ml 双抗溶液 1ml 7.5%NaHCO3 溶液 1-2ml HEPES 溶液 1ml 不完全 DMEM 培养基：DMEM 13.37g 超纯水或四蒸水 980ml NaHCO3 3.7g 双抗溶液 10ml 100L.G.溶液 10ml 用 1N HCl 调试 PH至 7.2-7.4，过滤除菌，分装 4保存。完全 RPMI-1640或 DMEM 培养基：不完全 RPMI-1640或 DMEM 培养基 80ml 小牛血清 15-20ml HT 或 HAT培养基：HT培养基 HAT培养基 完全 RPMI-1640或 DMEM 培养基 99ml 98ml HT贮存液 1ml 1ml A贮存液 1ml 氨基喋呤（A）贮存液（100，410-5mol/L）称取 1.76mg 氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于 90ml 超纯水或四蒸水中，滴加 1mol/L NaOH 0.5ml 中和，再补加超纯水或四蒸水至 100ml。过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20保存。次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液（100，H：10-2mol/L，T：1.6 10-3mol/L）称取136.1mg 次黄嘌呤（Hypoxanthine，MW 136.1）和38.8mg 胸腺嘧啶核苷（Thymidine，MW 242.2），加超纯水或四蒸水至 100ml，置 45-50水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20冻存。用前可置 37加温助溶。L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100，0.2mol/L）称取 2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用 100ml 不完全培养液或超纯水（或四蒸水）溶解，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20冻存。青、链霉素（双抗）溶液（100）取青霉素 G（钠盐）100 万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于 100ml 灭菌超纯水或四蒸水中，分装小瓶（4-5ml/瓶），-20冻存。7.5%NaHCO3溶液 胞克隆使其活化增殖并分化成为致敏淋巴细胞说明弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂北京康碧泉公司研制的佐剂上表中第每只小鼠注射个点为宜腹腔注射如果抗原混有弗氏佐剂建议注射在左侧腹腔如果采用右侧腹腔注射则在免疫过程中很胞数量会下降到未冲击前的水平二细胞融合材料和试剂骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株取体外培养对数生长期细胞称取分析纯 NaHCO3 7.5g，溶于 100ml 超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），盖紧瓶塞，4保存。HEPES 溶液（1mol/L）称取 23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羟乙基哌嗪-N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于 100ml 超纯水或四蒸水中，过滤除菌，分装小瓶（4-5ml/瓶），4保存。8-氮鸟嘌呤贮存液（100）称取 200mg 8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入 4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超纯水或四蒸水 99ml，过滤除菌；分装小瓶，-20冻存。使用时按 1%浓度加入到培养液中（即终浓度为 20ug/ml）。50%PEG 称取 PEG 1000 或 4000 20-50g 于三角瓶中，盖紧，60-80水浴融化，0.6ml 分装于青霉素小瓶中，盖紧，8 磅高压蒸汽 15 分钟，-20存放备用。临用前加热融化，加等量不完全培养基，用少许 7.5%NaHCO3调 PH至 8.0，或购买 Sigma 或 Gibco 公司现成产品。（5）24 孔及 96 孔培养板等细胞培养所用材料和试剂。【操作步骤】（1）将准备好的骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按 1：51：10 比例混合，加入 2050ml RPMI-1640液。（2）1000r/min 610min 离心弃上清，将上清尽量吸净。（3）用手指轻轻击打离心管底部，使沉淀细胞分散，将离心管置 37水浴中。（4）吸取 1ml 37预温的 50PEG缓慢滴入离心管内，45 秒左右加完，边加边轻轻搅拌，37静置 15min。（5）在 5min 内滴加不完全完全培养液(37 预温)20ml，第一分钟内滴加 1ml，第 2 分钟 2ml，第 3 分钟 5ml，第 4 和第 5 分钟各 6ml，同时应边加边轻轻地转动离心管，应沿管壁滴加，不应直接滴加在沉淀细胞上，以防将刚融合的细胞冲开。然后加 1640 液至 50ml 使 PEG作用终止。（6）800r/min 510min 离心，弃上清。（7）将沉淀细胞轻轻悬浮于所需容积的 HAT 培养液中，接种 24 孔板（每孔 1.0-1.5ml）或 96 孔培养板（每孔 0.10-0.15ml）。（8）接种完毕后，将培养板放入 37 5 CO2 温箱中培养。PS:1、冻存的骨髓瘤细胞在复苏后要 2 周时间才能处于适合于融合的状态，培养目标是使处于对数生长的时间尽可能长。2、饲养层细胞应在使的前一天制备好，这样才能分泌足够的细胞因子。三、选择性培养 原理：在 HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成 DNA 而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核胞克隆使其活化增殖并分化成为致敏淋巴细胞说明弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂北京康碧泉公司研制的佐剂上表中第每只小鼠注射个点为宜腹腔注射如果抗原混有弗氏佐剂建议注射在左侧腹腔如果采用右侧腹腔注射则在免疫过程中很胞数量会下降到未冲击前的水平二细胞融合材料和试剂骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株取体外培养对数生长期细胞糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在 HAT培养基中存活和增殖。（1）接种 24 孔板或 96 孔板 5 天后，用 HAT培养基换出 1/2 培养基。（2）7-10 天后用 HT培养基换出 HAT培养基；（第 14 天后可用普通完全培养基）。PS:1、经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积 1/10 以上时吸出上清供抗体检测。四、杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化 杂交瘤细胞在融合后 2 周左右即可筛选，选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力，通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定，一般制备单抗的目的决定了筛选克隆所用的方法。由于融合后，细胞上清份数多，但每份体积有限，因此 ELISA 是最适合用于初步筛选的方法。经过 ELISA 筛选出的阳性克隆即可进行克隆化，因为如果不进行克隆化，当阳性孔有非抗体分泌型的杂交瘤时，非抗体分泌型的杂交瘤由于生长速度更快，将会占主导生长，最终很难分离出目标杂交瘤以至丢失。另外杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的，有的细胞丢失部分染色体，可能丧失产生抗体的能力。通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行 2-3 次克隆化，有时还需进行多次。克隆化的方法很多，如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪（FACS）分离法。（1）包被 将抗原以 pH 9.6 的 NaCO3-NaHCO3 包被，每块酶标板以 5-20 ug 抗原为宜（如果抗原为多肽或小分子物质，则需要加大包被量）。每孔的包被体积为 50-100 ul。37 包被 2 h 或 4 包被过夜。（2）封闭 倒掉抗原，拍干酶标板孔内液体，以 0.5-1%BSA（用 PBST溶解）或 5%脱脂牛奶（PBST溶解）或 1%明胶（PBST溶解）于 37 封闭 2 h 或 4 封闭过夜，也可以使用 10%小牛血清或其它无关物种血清封闭。封闭完后可立即使用，也可以洗涤一次置于 4 密封保存以备后面使用。（3）一抗 封闭完后，弃去孔内液体，拍干，加入待检测细胞上清，每孔 100 ul 为宜。在每块板子上做好记号。37 孵育 1 h。（4）二抗 孵育完一抗后，弃去孔内液体，拍干，以 PBST洗涤 3 次，每次 5min。根据二抗说明稀释好二抗，每孔加入 100 ul.37 孵育 1 h。（5）显色 孵育完二抗后，弃去孔内液体，拍干，加入显色剂。待颜色最深时用终止液终止反应。用酶标仪读出各孔 OD值，选择出阳性孔。（1）有限稀释法 从有限稀释的原理以及影响因素可以知道，其克隆化结果应该是一个修正的泊松分布：胞克隆使其活化增殖并分化成为致敏淋巴细胞说明弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂北京康碧泉公司研制的佐剂上表中第每只小鼠注射个点为宜腹腔注射如果抗原混有弗氏佐剂建议注射在左侧腹腔如果采用右侧腹腔注射则在免疫过程中很胞数量会下降到未冲击前的水平二细胞融合材料和试剂骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株取体外培养对数生长期细胞式中在有限稀释里的意义是稀释时设计的每孔细胞的平均数,k 则代表可能出现的细胞个数。材料：a、96 孔细胞培养板等；b、HT培养基；c、活力强的杂交瘤细胞；d、小鼠腹腔细胞。方法：a、制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）。b、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含 20%血清的 HT培养基稀释至每毫升含 2.5、15 和 50 个细胞 3 中不同的稀释度。c、按每毫升加入 5104-1105细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。d、每种杂交瘤细胞分装 96 孔板一块，每个稀释度 32 孔，每孔量为 0.2ml，每孔的杂交瘤细胞数分别为 0.5、3 和 10。e、37、7.5%CO2 湿润培养 7-10 天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。f、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。g、本法中（b）、（c）、（d）也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释，直至每毫升含 10 个细胞，按每孔接种 0.1ml 细胞悬液，即每孔含 1 个细胞。（2）软琼脂法 材料：a、HT培养基（双倍浓度）。b、用 0.15mol/L NaCl配制的 2.0%琼脂糖：称取 2.0g 细胞培养用琼脂糖，悬浮于 100ml 0.15mol/L NaCl，121高压灭菌 15 分钟，分装 10ml 小瓶，冷却后 4保存。c、小鼠腹腔细胞。d、灭菌平皿。e、45水浴。f、活力很好的杂交瘤细胞。方法：a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。b、临用前将 2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的 HT培养液混匀，配成 1%琼脂糖培养液，45水浴中温育。c、吸去平皿上层培养液，加入 1%琼脂糖培养液 3ml，室温 10 分钟。d、取杂交瘤细胞悬液 1ml，加入 1%琼脂糖培养液 1ml 混匀，铺于上层。e、37、7.5%湿润培养 7-14 天；克隆生长至 2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的 24 孔板，扩大培养。f、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。PS：1、细胞融合后，一旦鉴定可以产生目标抗体，就应立即进行克隆化，确保能分离出单个细胞重新形成克隆。2、经多次尝试，确定修正公式中的 a 值，为以后的实验提供一个比较稳定的经验值。3、应在克隆前 1 天制备好饲养细胞层。胞克隆使其活化增殖并分化成为致敏淋巴细胞说明弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂北京康碧泉公司研制的佐剂上表中第每只小鼠注射个点为宜腹腔注射如果抗原混有弗氏佐剂建议注射在左侧腹腔如果采用右侧腹腔注射则在免疫过程中很胞数量会下降到未冲击前的水平二细胞融合材料和试剂骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株取体外培养对数生长期细胞五、单克隆抗体的大量制备 单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内诱生腹水法和体外培养法。1.用 20G或 22G的注射针，小鼠腹膜内注射降植烷，每只鼠 0.5 1 ml，1 周后接种细胞。2.在 175 cm2培养瓶中加完全 DMEM-10/HEPES/丙酮酸钠培养液，进行杂交瘤细胞的培养，使细胞生长至对数期。3.将培养液转入 50 ml 锥形离心管中，室温下 500 g 离心 5 min。4.细胞重悬于 50 ml 无菌的 PBS或 HBSS（不含 FBS）中洗涤。然后室温下 500 g 离心 5 min，弃上清。重复 2 次，然后细胞重悬于 5 ml 的 PBS或HBSS中。5.计数细胞，通过台盼蓝染色法确定细胞活力。6.用不含 FBS的 HBSS或 PBS调整细胞浓度至 2.5 102细胞/ml。7.用一个 10 ml 的无菌的带 22G针头的注射器，对裸鼠进行腹膜内注射2 ml 细胞，等待腹水形成（12 周）。8.收获腹水。（1）一只手抓住并固定小鼠，使其腹部皮肤绷紧。（2）另一只手将一只 18G的计头插入小鼠腹腔 12 cm 深。（3）进针部位为左下腹或右下腹，以避免刺入鼠上腹部的重要器官，以及腹中线处的主要大血管。（4）令腹水滴入一只无菌的 15 ml 聚丙烯锥形离心管中。9.于室温下，1 500 g 离心腹水 10 min，收集上清，弃沉淀，将腹水存放于 4，直到收集腹水的工作完成（在 1 周内）。10.再次收获腹水前，让小鼠再次积累腹水（23 天），具体操作同步骤 8，腹水的加工处理操作同步骤 9。重复这个过程直到再没有腹水产生可供收集，或者小鼠健康状况不佳。11.把在几天内收集到的腹水汇集到一起，于 56水浴 45 min 进行热处理，如果凝块形成，可用牙签挑出除之，然后再离心。12.采用适当的方法检测腹水中的 MAb的效价。13.按大于 1：10 的比例稀释 MAb，并进行滤过除菌，滤膜孔径为 0.45 m，分装并冻存于-70，避免反复冻融，可冻存数年之久。PS：1、腹水含有大量的油脂、巨噬细胞、杂交瘤细胞、腹腔内的上皮细胞、血液中的细胞成份等杂质，应先离心除去这些成份。2、油脂的密度比较小，一般都漂浮在腹水表面，用枪吸出丢掉即可。六、辛酸-硫酸铵两步沉淀法纯化单抗 1、原理 在酸性条件下(pH4.5)，非 IgG 的蛋白成份(包括白蛋白，部分 Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为 IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的 IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。胞克隆使其活化增殖并分化成为致敏淋巴细胞说明弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂北京康碧泉公司研制的佐剂上表中第每只小鼠注射个点为宜腹腔注射如果抗原混有弗氏佐剂建议注射在左侧腹腔如果采用右侧腹腔注射则在免疫过程中很胞数量会下降到未冲击前的水平二细胞融合材料和试剂骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株取体外培养对数生长期细胞 2、方法 （1）将腹水用 0.06 M 醋酸钠(pH4.0）按 1：3 稀释，用 1mol/L NaOH 调至血清稀释液为 pH4.5。（2）室温下边搅拌(磁力搅拌器 或电功搅拌器)，边缓慢滴加辛酸(一般按每毫升稀释前的腹水加入 40 ul 正辛酸)，滴加完后继续搅拌 30min。（3）4 静置 2 h。（4）4 10000 g 离心 20min，可见辛酸因温度低而从系统中结晶析出漂浮在腹水上层，用多层纱布过滤，弃去此结晶以及底部沉淀，收集上清夜。（5）向上清中加入 1/10 体积的 10PBS（0.1M，pH 7.4)。（6）4 条件下，向其中加入饱和硫酸铵溶液，使终浓度为 45饱和度，静置 1h 以上。（3）10000 g 离心 10-20min；弃上清，将沉淀溶于适量 1 PBS中，再将其装入透析袋用 10mM 的 tris或 PBS透析（透析液应为抗体体积的 100 倍以上，最好搅拌），4 过夜。（4）收集透析好的抗体，直接现用或加入保护剂和防腐剂长期保存（-20保存或冻干保存）。用这种方法纯化出来的抗体纯度可达 80-90%左右，损失较少，对抗体的活性损失也较少，试剂成本低，但是操作比较费时。3、蛋白含量测定 紫外分光光度法测样品在波长 260nm，280nm处的 I 及收光度(A 260,A 280)，蛋白含量按以下公式计算 蛋白量（g/L）=(1.45 A280-0.74 A 260)稀释倍数 注：1、单抗制备（小鼠）中的杂交瘤细胞是半贴壁型的细胞。2、在使用之前需要加入 15%-20%胎牛血清，胎牛血清可以为细胞提供更多的生长因子和激素等活性物质。3、HAT选择培养基中，H（次黄嘌呤）的浓度为 110-4 M，A（氨基蝶呤）为 410-7M，T（胸腺嘧啶）为 1.6 10-5 M，在 HT培养基中，只需要不加氨基蝶呤，其它都同 HAT。进行选择性杀死非目标细胞。4、为防止细胞污染，通常用的抗生素有青霉素（100 U/ml）和链霉素（100 ug/ml）、四环素(50 ug/ml)、庆大霉素（50 ug/ml），其中青霉素和链霉素联合使用较为常用，俗称“双抗”。胞克隆使其活化增殖并分化成为致敏淋巴细胞说明弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂北京康碧泉公司研制的佐剂上表中第每只小鼠注射个点为宜腹腔注射如果抗原混有弗氏佐剂建议注射在左侧腹腔如果采用右侧腹腔注射则在免疫过程中很胞数量会下降到未冲击前的水平二细胞融合材料和试剂骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株取体外培养对数生长期细胞 5、取少量分装的培养基加入至液体 LB培养基里 37 培养过夜进行无菌测试（其它 4 保存），确认培养基无菌后才能使用。6、LB 培养基的配制：胰蛋白胨(tryptone)10g 酵母提取物(yeast extract)5g 氯化钠(NaCl)10g 固体培养基另加琼脂粉 15-20g 加双蒸水至 1000mL,用 5mol/L NaOH（约 0.2ml）调 pH至 7.2，121灭菌 30min。7、融合所用的瘤细胞是选择出来的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase,HGPRT）和胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)缺陷细胞株，从而能有效地阻断瘤细胞 DNA 合成的外源性途径。8、在瘤细胞利用磷酸核糖、氨基酸、CO2和 NH3等化合物合成核苷酸过程中，叶酸是重要的辅酶，而氨甲蝶呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞 DNA合成的内源性途径。胞克隆使其活化增殖并分化成为致敏淋巴细胞说明弗氏完全佐剂弗氏不完全佐剂北京康碧泉公司研制的佐剂上表中第每只小鼠注射个点为宜腹腔注射如果抗原混有弗氏佐剂建议注射在左侧腹腔如果采用右侧腹腔注射则在免疫过程中很胞数量会下降到未冲击前的水平二细胞融合材料和试剂骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株取体外培养对数生长期细胞
