质粒电泳,质粒DNA电泳三条带.docx

质粒电泳，质粒DNA电泳三条带2022质粒电泳，质粒DNA电泳三条带正文内容质粒DNA电泳的三条带质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA,是进行DNA 重组的常用载体.作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色 体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表 现相应的性状.在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒 载体可通过连接外源 基因构成重组体.从宿主细胞中提取质粒DNA,是DNA重组技术中最基础的实 验技能.分离质粒DNA有三个步骤：1,培养细菌使质粒扩增2,收集和裂解细 菌3,分离和纯化质粒DNA碱裂解法是较常用的提取的方法.其优点是得率高， 适合于大多数的和菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作.此法 采取酸碱度高达Phl2. 6的碱溶液使DNA发生变性.由于质粒和主染色体的拓 扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，但仍然缠绕在一起不分开；而后者完 全变性分，甚至出现断裂.因此，当加入中和液时，溶液Ph值恢复较低的近中性 水平，此时，质粒的两条小分子单链可迅速复性，恢复双链结构，但是主染色体 DNA则无法复性.在离心时,大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀, 而可溶性的质粒DNA留在上清夜中.在质粒提取过程中，由于机械力，酸碱度， 试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂.所以，多数 质粒粗提取物中含有 三种构型的质粒：共价闭合环状DNA(cccDNA)：质粒的两条链没有断裂；超螺旋 开环DNA(ocDNA)：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子 线形DNA(IDNA)：质粒 的两条链均断裂；线性分子质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图质粒DNA的分子构型由于琼脂糖中加有嵌 入型染料漠化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色.(a)松弛线性 的DNA； (a)道中的SC DNA走在最前沿,0C DNA则位于凝(b)松弛开环的0C 构型；(c)超螺旋的SC构型 胶的最后边；(b)道中的LDNA是经核酸内切限制 酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA和SC DNA之间三，材 料，试剂及器具1,材料E. coliDH 5a (pUC 19 vector) 2,试剂1)LB培养基 2)TE缓冲液3)裂解液:溶液I ,溶液H,溶液HI 4)酚：氯仿：异戊醇解5：24：1) 5)无水乙醇6)70%乙醇7)氨羊青霉素50mg/mL器具 离心机，离心管，吸嘴 四， 操作步骤以设比例把E. coliDH5a (含PUC接种于含氨节青霉素 (Amp)100iig/nil)的LB培养基 中372振摇过夜(12-18h) I取1.5ml培养 物置离心管中I lOOOOrpm,离心Imin,或4000rpm,离心5-10min !去上清， 倒扣干净吸收纸上吸干I沉淀+100UL溶液I I加或不加入少量溶菌酶粉 末；混匀，室温放置lOmin ； +加200 Li L溶液11(新鲜配置)；温和颠倒数次, 混匀，冰上放置5min I +150 u 1溶液Hlf颠倒混匀，冰上放置15min I离心12000rpm, 15min !上清液+等体积酚：氯仿：异戊醇振匀,12000rpm,离心 5min I小心转移上层至一新的离心管弃下层有机相和中层蛋白质I上清液 +2倍体积无水乙醇混匀，室温5min-10min 3 12000rpm, 5min-15min I弃上清 沉淀+lmL70%乙醇I 12000rpm离心5min-15min I弃上清；并倒扣离心管使液 体流干1+自然干燥或真空抽干(看不到液滴为宜)I加50 u 1TE缓冲液 (20ug/mlRNaseA)溶解质粒粗取物I -20。(3保存 六，实验报告 检查，保存提取 的质粒，要求记录实验现象并说明原因.七，思考题 分析以下试剂的作用原理: 溶液I ：50mmol/L葡萄糖5mmol/Ltris HCL (Ph 8. 0) 10mmol/L EDTA(PH8. 0)溶液 II ： 0. 4mol/L NaOH 2% SDS 使用前新鲜配制溶液HI： 5moi/L Kac 60 mL冰醋酸IL 5 mL水28.5 mL RNase A 酶：将粉末溶于 10mmol/L tris HCL (Ph7. 5), 15mmol/L NACL 中，配成 10 mg/mL浓度的酶液，于100水浴加热15 min,缓慢冷却至室温，-20保存 氯 仿无水乙醇质粒电泳，质粒DNA电泳三条带正文内容结束。