丙二醛的测定.docx

丙二醛的测定一、试齐IJ :(1) TBA水溶液：精确称取TBA0.288g溶于水中，并稀释至100ml (如TBA不易溶解，可加热至全溶澄清，然后稀释至100ml ),相当于0.02M ;(2)三氯乙酸混合液：精确称取三氯乙酸(分析纯)7.5g及0.1gEDTA ,用水溶解，稀释至100ml ;氯仿(分析纯)；(4)丙二醛标准溶液：称取0.315gl ,1,3, 3-四乙氧基丙烷，溶解后稀释至1000ml , 此溶液每ml相当于丙二醛lOOpg，置于冰箱内保存。精确吸取1ml稀释至100ml ,此溶液每ml相当于丙二醛lpg ,备用。操作步骤(1)标准曲线的绘制精确吸取每ml相当于丙二醛Ipg的标准溶液0.0、0.1. 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6ml置于纳氏比色管中，加水至总体积为1ml ,加入4mlTBA溶液，然后按样品测定步 骤进行，测得光密度绘制标准曲线。(2)样品制备与检测精确称取匀称的豆油15g ,置于100ml有盖三角瓶内，加入25ml三氯乙酸混合液，振摇半小时(保持油脂融溶状态，如冷结即在70(水浴上略微加热使之溶化后连续 振摇)用双层滤纸过滤，除去油脂。滤液重复用双层滤纸过滤一次。精确移取上述滤液10ml置于25ml比色管内，加入lOmITBA溶液，混匀，加塞,置于90水浴内保温40min ,取出，冷却lh ,移入小试管内,离心5min ,上清液 倾入25ml纳氏比色管中，加入5ml氯仿，摇匀，静置，分层，吸出上清液于532nm波 特长,用2cm比色皿比色(同时作空白试验X4.计算光密度(A532/kg)=丙二醛含量(mg/Kg )=材料、仪器、药品1 .材料：植物抗逆性鉴定试验中的四种菠菜样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室 温对比。2 .仪器：(1)分光光度计； 离心机；(3)水浴锅：(4)天平； 研钵； 剪刀; 5ml刻度离心管；(9)刻度试管(10ml) ; (10)银子；(11)移液管(5ml、2ml、lml); (12 )冰箱。3 .药品：(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液;(2)石英砂；5%三氯乙酸溶液： 称取5g三氯乙酸，先用少量蒸储水溶解，然后定容到100ml ; (4) 0.5%硫代巴比妥酸溶 液：称取0.5g硫代巴比妥酸,用5%三氯乙酸溶解，定容至100ml ,即为0.5%硫代巴比 妥酸的5%三氯乙酸溶液。方法1 .丙二醛的提取：取0.5g样品，加入2ml预冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸缓冲液, 加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用 缓冲液洗净清洗也移入离心管中最终用缓冲液定容至5ml。在4500转/min离心lOmin。 上清液即为丙二醛提取液。2 .丙二醛含量测定：吸取2 ml的提取液于刻度试管中,加入0.5%硫代巴比妥酸的 5%三氯乙酸溶液3ml ,于沸水浴上加热lOmin，快速冷却。于4500转/min离心10mino 取上清液于532、600nm波长下，以蒸储水为空白调透光率100% ,测定吸光度。3 .结果计算:(A532A600) xVlxV4 .55xlO-lxWxV2丙二醛含量(nmol/g )=式中：A为吸光度;VI为反应液总量(5ml) ; V为提取液总量(5ml) ; V2为反应液中 的提取液数量(2ml) ；W为植物样品重量(0.5g) ；1.55xl0-l为丙二醛的微摩尔吸光系数在 1升溶液中含有丙二醛时的吸光度X4.留意事项:(1) 0.10.5%的三氯乙酸对MDATBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性汲取偏高；(2) MDATBA显色反应的加热时间，最好掌握沸水浴1015min之间。时间太短或 太长均会引起532nm下的光汲取值下降；(3)如用MDA作为植物年轻指标，首先应检验被测试材料提取液是否能与TBA反应 形成532nm处的汲取峰。否则只测定532、600nm两处A值，计算结果与实际状况不符, 测得的高A值是一个假象；(4)在有糖类物质干扰条件下(如深度年轻时)，吸光度的增大，不再是由于脂质过氧化 产物MDA含量的上升，而是水溶性碳水化合物的增加，由此转变了提取液成分，不能再 用532nm、600nm两处A值计算MDA含量，可测定510、532、560nm处的A值， 用A532 -(A510A560)/2的值来代表丙二醛与TBA反应液的吸光值。