二维差异凝胶电泳(2DDIGE)技术在昆虫学研究中的应用.docx

二维差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术在昆虫学争论中的应用摘要随着科学技术的迅猛进展，现代生物学技术已经进展到后基因组时代，蛋白质组学是在整体水平上争论细胞内蛋白质组成及其活动规律的兴学 科。二维差异凝胶电泳Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE 技术是在双向凝胶电泳Two-dimensional electrophoresis，2-DE根底上进展起来的一种兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术，是分析和鉴定基因功能的强有力工具，比经典的 2-DE 技术具有更高的动力学范围和灵敏性。该文就 2D-DIGE 技术的进展以及在昆虫争论上的应用前景进展了展望。关键词二维差异凝胶电泳；蛋白质组学；昆虫1 争论背景随着大量生物体全基因组序列的提醒，特别是人类基因组测序打算的完成， 标志着生命科学争论取得了极其重要的阶段性成果，同时也标志着生命科学正式进入崭的后基因组时代1-2，争论的重心也从提醒遗传信息构造的基因组学转移到功能基因组学上来，蛋白质组学作为高通量的蛋白质分析方法，也将对功能基因的争论做出巨大奉献。蛋白质作为基因表达的产物与生命活动的执行者，直接表达了生命现象的简单性和多变性。因此，只有对实现最终功能的蛋白质进展分析鉴定，才能更好地描述细胞活动或行使功能的动力学过程，才能更贴近对生命现象和本质的把握。二维差异凝胶电泳 Two dimensiondifference gel electrophoresis，2D-DIGE技术是分析和鉴定昆虫基因功能的强有力工具，其是在双向凝胶电泳Two-dimensional electrophoresis，2-DE根底上进展起来的一种兴的荧光标记的定量蛋白质组学技术，在生物学各个领域得到广泛的应用3-6。2D-DIGE 在昆虫免疫调整、生理发育、昆虫毒理学以及传毒媒介昆虫的传毒机制等领域的应用也变得越来越广泛，其争论结果受到科学家们的高度重 视。该文就二维差异凝胶电泳技术的进展以及在昆虫学争论中的应用进展探讨。2 二维差异凝胶电泳技术的进展2.1 蛋白质组与蛋白质组学蛋白质组proteome一词由澳大利亚 Macquaie 大学的 Wilkins 和 Williams 于 1994 年在意大利的一次科学会议上首次提出，指在特定的生理和病理条件下一个基因组或一个细胞、组织表达的全部蛋白质7。蛋白质组学proteomics 是后基因组时代产生的一门兴学科，是以蛋白质组为争论对象，大规模、系统地争论蛋白质的特征及构造，包括蛋白质的表达水平、翻译后修饰、蛋白质组成分的动态变化、蛋白质间的相互作用和相互联系等，旨在从整体水平上说明生命现象的本质和活动规律8。蛋白质组学是分子争论的终点，也是对生物体性状的最直接反映，同时也是目前争论最多、成果较丰富的学科。2.2 双向凝胶电泳技术近年来，蛋白质组学技术已经日趋成熟和完善，并被广泛应用于生命科学的各个领域，在昆虫学争论中也得到了广泛应用。自从 1975 年 OFarrel和lK9lose等人建立双向凝胶电泳技术2-DE以来，2-DE 技术凭借其高灵敏度和高区分率、便于计算机进展图像分析处理、可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配等优点成为目前蛋白质组学争论的核心手段。2-DE 技术是利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异性，通过 2 次凝胶电泳到达分别蛋白质组的技术。第一向电泳依据蛋白质等电点的不同，通过等电聚焦isoelectric focusing，IEF将带有不同净电荷的蛋白质进展分别。其次向十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-是依据蛋白质分子质量的不同将蛋白质与 SDS 形成复合物后在聚丙烯酰胺凝胶电泳中进一步分别。由于2-DE 技术在样品制备、电泳条件和凝胶染色等条件上无法完全全都而产生胶间差异，使试验重复性差，敏感度低，甚至可能掩盖样品间真正的生物学差异或产生假阳性5。此外，膜蛋白样品溶解性、低丰度蛋白质检测、极酸极碱性蛋白质降解、电泳图谱的分析、低分子量和高分子量蛋白质分别等也是制约 2-DE 技术应用和进展的瓶颈。2.3 二维差异凝胶电泳技术为了解决 2-DE 技术存在的缺陷，Unlü et al10提出了荧光二维差异凝胶电泳技术Two dimension difference gel electrophoresis，2D-DIGE。2D-DIGE 技术是目前蛋白质组学争论中可信度、敏感度和准确率最高的技术之一，该分析系统是建立在传统的双向电泳技术的根底上，在双向电泳前先对蛋白样品进展荧光如 Cy2，Cy3，Cy5标记，然后把标记好的蛋白质样品进展混合，同时在一块凝胶上进展电泳。2D-DIGE 技术结合了多重荧光分析的方法，在同一块凝胶上能同时分别出多个分别由不同荧光标记的蛋白质样品，并第一次引入了内标internal standard的概念，更好地消退了试验的偶然误差，避开了不同凝胶之间的差异，极大地提高了结果的准确性和可信度11。在 2D-DIGE 技术中，每个蛋白质点都有相应的内标，软件自动依据每个蛋白质点的内标对其表达量进展校准，从而抑制了不同凝胶间电泳造成的蛋白质点位置和量的差异，这样可以很好地去除蛋白质样品的假阳性差异点12。另外，2D-DIGE 技术不需要进展电泳后的固定或脱色过程，可以削减蛋白质特别是低分子量蛋白质的损失13。2D-DIGE 技术的原理是先用不同的荧光染料标记蛋白质样品，再使蛋白质变性，然后用固定 pH 梯度凝胶，依据蛋白质电荷差异分别出不同 pH 值的蛋白质带，再将此胶条置于含 SDS 的聚丙烯酰胺凝胶上，依据蛋白质分子量加以分别，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的SDS- 凝胶图像14。其主要步骤：用 2 种不同的荧光染料花青Cy2、Cy3 或 Cy5标记要比较的蛋白质样品；等量均匀混合荧光标记后的样品；使用一样的内标，将混合后的样品经双向凝胶电泳进展分别；在荧光显微镜下，用不同的激发波长来检测电泳结果15。2D-DIGE 技术可以全面地观看到 2 种样品蛋白质表达间的差异，避开了不同凝胶之间的差异对结果分析带来的影响，保证了试验条件的全都性，有利于差异蛋白质表达点的筛选。同时承受不同波长的扫描，通过观看一个蛋白质点 2 种荧光密度的深浅或有无，可以获得有关特定蛋白质点丰度的变化、蛋白质的缺失或是否有蛋白质消灭等信息。3.3 在昆虫免疫学上的应用果蝇是争论昆虫自然免疫力的重要模式生物，为争论昆虫自然免疫力与人类自然免疫力的相关性架起了桥梁。通过承受 2D-DIGE 技术，Vierstraete et al26 比照分析了被革兰氏阴性细菌藤黄微球菌及酵母菌感染的果蝇 3 龄幼虫和比照组幼虫血淋巴蛋白质组的变化。争论结果说明，被革兰氏阴性藤黄球菌和酵母菌感染的果蝇 3 龄幼虫，其血淋巴中分别有 20 个和 19 个蛋白质点表达量上调。运用生物质谱鉴定技术对表达量有差异的蛋白质进展鉴定，觉察多数差异点为同一蛋白质，说明存在翻译后修饰过程。这些有差异性的蛋白质，大多数对一种病菌有特别的调整作用，但是当应对一些刺激时，如脂多糖类的刺激，只有相当少数的蛋白质发生转变。在未被感染的果蝇幼虫血淋巴中蛋白质表达量没有增加，因而蛋白质表达量的增加与免疫系统的特别作用有亲热关系。随后，之前未被标识的免疫蛋白也被鉴定出来，如 CG4306 蛋白质，并确定了它的同系物在多细胞动物基因组数据库中所具备的功能。3.4 在传毒媒介昆虫上的应用昆虫往往是某些微生物的寄主和传播病毒病的媒介，利用蛋白质组学争论寄主昆虫与病原物间相互关系，可为植物病害治理及人畜疾病预防与治疗供给理论根底27。尽管越来越多的证据说明病原体对被感染寄主有行为操纵的作用，但大多数状况下，被感染寄主在利于病原体传播的潜在机制中所扮演的角色还是未知的。冈比亚按蚊Anopheles gambiae作为恶性疟原虫的寄主，是目前争论最多的媒介昆虫，Lefevre et al28承受 2D-DIGE 技术对被疟疾感染的冈比亚按蚊和未被感染的冈比亚按蚊的头部蛋白质组进展了分别分析。结果说明，被感染的蚊子头部有 12 个蛋白质发生差异性表达，质谱鉴定显示这些差异蛋白质主要与代谢、信号传导、分子伴侣及细胞骨架相关。这些差异蛋白质的觉察提醒了其行为修饰的内在分子机制，也为疟原虫与冈比亚按蚊相互作用的争论供给了的方法。昆虫所携带的传染病病毒引起了很多型的、感染力量强的传染病。在这些虫媒病毒中，登革热病毒和曲屈公病毒是在全世界范围内引起人类疾病的重要病毒。蚊子的中肠是防止病菌感染的第一道障碍，同时也是虫媒病毒在感染其他组织器官之前必需要复制的靶标器官。Tchankouo-Nguetcheu et al29承受 2D-DIGE 技术争论病毒与被感染媒介昆虫的相互关系以及被感染媒介昆虫中肠蛋白质组的变化。结果觉察埃及伊蚊Aedes aegypti通过口器感染 7DPI 的登革热型病毒和曲屈公病毒 7d 后，其中肠蛋白质表达量发生了明显变化，凝胶成像比照显示，登革热型病毒引起了 18 个蛋白质点差异性变化，曲屈公病毒引起 12个蛋白质点差异性变化，这 2 种病毒以一样或不同的方式引起 20 个一样蛋白质点发生差异表达。登革热型病毒和曲屈公病毒感染造成了一样世代的埃及伊蚊中肠内与氧化反响、能量代谢、糖类和脂质陈代谢相关蛋白质量的增加。此外， 曲屈公病毒引起了一系列与解毒亲热相关蛋白质量的增加。争论还觉察，被病毒感染后所发生差异性表达的蛋白质主要包括构造蛋白、调整蛋白以及与氧化复原作用和陈代谢相关的酶类，在这些蛋白质中，有些蛋白质与细胞对抗氧化剂的防卫有亲热关系；而一些调整蛋白例如铁传递蛋白、热休克蛋白 60 和麦芽糖酶， 可能对病毒的生存、复制、传播有利，这也就意味着虫媒病毒对昆虫细胞的陈代谢会产生破坏。这一争论是对埃及伊蚊被不同种类的病毒感染后中肠蛋白质差异性表达的首次争论。登革热型和型病毒很可能是造成多种传染病的最初传染源，但是目前支持这种假设的报道很少。Patramool et al30运用 2D-DIGE 技术，分析白纹伊蚊Aedes albopictus被登革热型和型病毒感染期间细胞系蛋白质差异性表达。通过大量观看争论，白纹伊蚊在被登革热型和型病毒感染 48 h 后，与细胞应激反响和糖酵解过程相关的蛋白质发生了超表达。病毒性感染激活了某些寄主基因的翻译过程，很可能会给未激活蛋白质的回应带来压力，白纹伊蚊体内的氧化复原和糖酵解生化过程也参与抵抗登革热型和型病毒反响机制中。该争论在细胞水平说明白登革热病毒蚊子相互作用的机制，并且对制订有效的掌握登革热病毒策略有重大意义。3.5 在昆虫与寄主植物相互作用上的应用番茄植株被马铃薯长管蚜Macrosiphum euphorbiae取食后，植株生长矮小，产量下降，并且会造成植株顶梢枯死，叶片畸形坏死，甚至导致植株死亡31。抗虫番茄植株中的 Mi-1.2 基因对无致病力马铃薯长管蚜的无性生殖个体具有抗性。无致病力的马铃薯长管蚜在抗性寄主上的存活率很低，然而有致病力的马铃薯长管蚜在抗性寄主上有很高的存活率。Francis et al32通过承受 2D-DIGE 技术与质谱检测相结合的技术，比照分析了无致病力和有致病力的马铃薯长管蚜及其细菌内共生体在抗病和感病番茄寄主上蛋白质组的转变。结果说明，在 4 组试验中共鉴定出 82 个蛋白质点发生差异性表达，其中 48 个蛋白质点鉴定为同一类， 有致病力和无致病力的马铃薯长管蚜相比，其体内与陈代谢严密相关的构造蛋白和酶类更加丰富。当把有致病力的马铃薯长管蚜从感病寄主转移到抗性寄主上时，其体内一些蛋白质表达量会上调，在这些差异性表达的蛋白质中，接近 1/4 的蛋白质发源于马铃薯长管蚜内共生体而不是其本身，同时鉴定出 6 个表达量上调的蛋白质发源于原始的蚜虫内共生菌，5 个表达量上调的蛋白质很可能起源于第 2 代立克次氏体内共生菌。该争论证明白有致病力和无致病力马铃薯长管蚜体内的细菌内共生体蛋白质表达量也存在很大差异，但它们都受到寄主植物的影 响，因此认为，细菌内共生体对马铃薯长管蚜适应抗性寄主有肯定的帮助作用。4展望2D-DIGE 技术的引入与创为昆虫蛋白质组学的争论分析供给了方法， 也是蛋白质差异表达技术真正意义上的变革。2D-DIGE 技术凭借敏感度高、重复性好、宽动力学范围等优势，更加适用于多种因素的简单试验设计和为蛋白质翻译后加工修饰供给相关信息。目前，2D-DIGE 技术已广泛应用于医学33、微生物34、植物3、昆虫等差异蛋白质争论领域，并取得了很大的成绩，极大地推动了蛋白质组学的进展。但是在进展蛋白质差异表达争论时， 2D-DIGE 技术也存在其自身的局限性，如荧光染料只能标记在赖氨酸残基上，无法标记或无法检测到不含赖氨酸的蛋白质；低丰度、疏水性、极端酸性或碱性的蛋白质难以检测。此外，染色、扫描设备的昂扬本钱和多个蛋白质点在凝胶中同一位置重叠也是限制其应用进展的难题。随着科学技术的不断进展，蛋白质组学争论技术将得到不断革和完善，制约 2D-DIGE 技术进展的瓶颈问题也将迎刃而解。信任2D-DIGE 蛋白质定量分析技术将极大地促进蛋白质组学争论进展，并与其他蛋白质组技术相互整合和互补，为生命科学争论供给一个强有力的工具。5参考文献1 HAN B，LI Y N，YI Y Z，et al.Advance in Differential Proteomics of Silkworm Bombyx moriJ.Biotechnology Bulletin，20236：1-5.2 LIUWX ， PANYH.TheDevelopmentofTwo-dimensional Electrophor-esis and Its Application in Agricultural Biological 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