分子实验手册.docx

一、真菌 RNA 提取试验原理在全部RNA 试验中，最关键的因素是分别得到全长的RNA。而试验失败的主要缘由是核糖核酸酶RNA 酶的污染。由于 RNA 酶广泛存在而稳定，一般反响不需要关心因子。因而RNA 制剂中只要存在少量的RNA 酶就会引起 RNA 在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA 的纯度和完整性又可直接影响RNA 分析的结果，所以RNA 的制备与分析操作难度极大。在试验中，一方面要严格掌握外源性RNA 酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA 酶。RNA 酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA 酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学试验中使用的 RNA 酶也会造成污染。这些外源性的RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、争论人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA 酶。防止RNA 酶污染的措施1. 全部的玻璃器皿均应在使用前于 180的高温下干烤 6hR 或更长时间。2. 塑料器皿可用 0.1% DEPC 水浸泡或用氯仿冲洗留意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇枯燥，再浸泡在3% H O 室温 10min，22然后用 0.1% DEPC 水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用 0.1% DEPC，在 37处理 12 h 以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22m滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，试验过程中手套要勤换。6. 设置RNA 操作专用试验室，全部器械等应为专用。常用的RNA 酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯DEPC：是一种猛烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂。它通过和 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的 RNA 酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使 RNA 酶失活。它既可破坏细胞构造使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA 酶有猛烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA 酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA 酶的活性。4. RNA 酶的蛋白抑制剂RNasin：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin 是RNA 酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA 酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA 酶也有肯定抑制作用。试验材料拟茎点霉菌体、研钵、锡箔纸、液氮、药匙、RNase-free 耗材1.5 ml 离心管、枪头、离心机、柱式真菌RNA 提取试剂盒、无水乙醇试验步骤1. 试验预备研钵和钥匙用锡箔纸包装，于 180烘箱烘烤 4h。柱式真菌RNA 提取试剂盒，按瓶身标签说明在 GT Solution、NT Solution 中参加相应量的无水乙醇， 混匀后在瓶身做好标记。于室温密封保存。每次使用后将瓶盖盖紧，以保持GT Solution、NT Solution 中的乙醇含量。2. 取 450 µl BuffeRRlysis-FG 参加 1.5 ml RNase-free 的离心管中备用3. 取 20 mg 枯燥的菌丝用液氮研磨成粉末，加到上述 1.5 ml 离心管中，马上震荡混匀，室温放置 5 min。留意 1：液氮研磨过程中要避开样品溶化，使用的研钵与药匙等工具应事先用液氮预冷。研磨后的样品应快速参加裂解液中震荡混匀，避开RNA 降解。留意 2：样品转入离心管时避开带入液态氮，由于液氮在封闭的离心管中快速转变成气体可能引起离心管的爆裂，请留意安全。4.12,000 rpm 4°C 离心 3 min，将上清移至 1.5 ml RNase-free 的离心管中。5. 参加 1/2 体积无水乙醇，充分混匀。留意 3：即使消灭沉淀也不要离心。6. 将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液全部加至吸附柱中，静置1 min，室温12,000 rpm 离心1 min，倒掉收集管中废液。留意 4：GT Solution 使用前请检查是否按比例参加无水乙醇。7. 将吸附柱放回收集管中，参加500 µl GT Solution，静置1 min，室温10,000 rpm 离心 1 min，倒掉收集管中废液。8. 将吸附柱放回收集管中，参加 500 µl NT Solution，静置 1 min，室温 10,000 rpm 离心 1 min，倒掉收集管中废液。9. 将吸附柱放回收集管中，室温12,000 rpm 离心 2 min。留意 5：此步绝不行省略，否则剩余的乙醇会严峻影响得率和后续试验。留意 6：将吸附柱翻开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的乙醇，乙醇的残留会影响RNA 的产量和后续的试验。10. 将吸附柱放入RNase-free 的 1.5 ml 离心管中，在吸附膜中心参加 3050 µl DEPC-treated ddH2O，静置 2 min，12,000rpm 离心 2 min，将所得到的RNA 溶液置于-80°C 保存或用于后续试验。二、RT-PCR试验原理逆转录-聚合酶链反响 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的 mRNA 作为模板，承受 OligodT或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以 cDNA 为模板进展PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使 RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、猎取目的基因、合成cDNA 探针、构建RNA 高效转录系统。试验材料RNA、第一链cDNA 合成试剂盒、ddH O、PCR 管、PCR 仪2试验步骤1.组分混合组分Total RNAAnchored Oligo(dT)18 Primer (0.5µg/µl) 2xES Reaction MixEasyScript® RT/RI Enzyme Mix gDNARemoverRNase-free Water Total volume2. 42孵育 30 min，85失活 5 s。体积50-5000 ng1 l 10l 1l 1lVariable20l三、目的基因扩增试验原理聚合酶链反响(Polymerase Chain Reaction ，PCR)是 80 年月中期进展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要争论的目 的基因或某一DNA 片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观看和推断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA 供分析争论和检测鉴定。类似于DNA 的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性-退火-延长三个根本反响步骤构成：模板DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93左右肯定时间后，使模板 DNA 双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作预备；模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；引物的延长：DNA 模板-引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反响原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条的与模板DNA 链互补的半保存复制链。重复循环变性-退火-延长三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2分钟，23 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。试验材料高保真扩增酶Mix、ddH2O、50XTAE 缓冲液、琼脂糖、核酸染料、上样缓冲液、核酸电泳仪、PCR 仪试验步骤1. 组分混合组分cDNA2 × Phanta Max Master Mix上游引物 (10 M)下游引物 (10 M) ddH2O体积25l3 l 12.5l 1l 1l7.5l2. PCR 反响程序循环步骤温度时间循环数预变性953min变性9515sec退火56-7215sec25-35延长7230-60sec/kb彻底延长725min四、琼脂糖凝胶电泳检测试验原理自然琼脂Agar是一种多聚糖，主要由琼脂糖Agarose，约占 80%及琼脂胶Agaropectin组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖， 由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电 泳速度及分别效果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进展平板电泳。琼脂糖凝胶电泳对核酸的分别作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有亲热关系。1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系（1） DNA 分子的大小在凝胶中，DNA 片段迁移距离迁移率与碱基对的对数成反比，因此通过大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当 DNA 分子大小超过 20kb 时，一般琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依靠于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分别DNA 时，分子大小不宜超过此值。（2） 琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA 需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进展电泳分别。琼脂糖浓度/%0.30.60.70.91.21.52.0线装DNA 大小/kb5-601-200.8-100.5-70.4-60.2-40.1-32、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分别的关系不同构型DNA 的移动速度次序为：供价闭环DNAcovalently closed circular，cccDNA>直线 DNA> 开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状 DNA一般为球形不能进入胶中，相对迁移率为0Rm=0，而同等大小的直线双链DNA刚性棒状则可以长轴方向前进Rm>0，由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。3、凝胶类型用于分别核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型平板型。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下 1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，由于它制胶和加样比较便利，电泳槽简洁， 易于制作，又可以依据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢送。4、缓冲液系统缺少离子时，电流太小，DNA 迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严峻时， 会造成胶熔化和DNA 的变性。常用的电泳缓冲液有 EDTApH8.0和 Tris-乙酸TEA，Tris-硼酸TBE或 Tris-磷酸TPE等，浓度约为 50mmol/L(pH7.57.8)。电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。试验方法1. 凝胶的制备称量适当琼脂糖溶于适当缓冲液中，微波炉加热到溶化透亮。放置冷却 3min，依据1 参加核酸染料， 倒入制胶板中，插入样品孔梳，自然冷却20min 以上。拔梳子将凝胶放入电泳槽中，样品孔靠近负极2. 样品配制与加样DNA 样品和适量上样缓冲液混合均匀，留神参加样品孔中，盖上电泳槽盖子，100V 运行 25 min。3. 凝胶成像将凝胶放入凝胶成像仪中，观看结果，照相分析五、PCR 产物回收试验原理利用异硫氰酸胍法溶胶，利用硅胶膜离心柱特异地吸附DNA，适用于从 TAE 或 TBE 琼脂糖凝胶中回收 DNA 片段。试验材料手术刀、1.5 ml 离心管、胶回收试剂盒、离心机试验步骤1. 当DNA 片段分别后，把凝胶放置于紫外灯下，快速切下含目的DNA 片段的凝胶，并尽量去除多余的凝胶。2. 称取凝胶块的重量，并转移至1.5ml 离心管中。按 100mg 凝胶块相当 100µl 体积计算，参加等倍体积 Buffer GDP。5055ºC 水浴 710 分钟，让凝胶块完全溶解。水浴期间，颠倒混匀2 次加速溶胶。假设凝胶块重量为 200mg，则参加 200µl Buffer GDP。(Buffer GDP 参加 13 倍体积都不影响DNA 回收率。) 假设回收小于或等于 100bp DNA 片段时，参加3 倍体积 Buffer GDP，水浴溶胶后，再参加1 倍体积(凝胶体积) 异丙醇混匀后再按第三步进展操作。3. 短暂离心收集管壁上的液滴。将HiPure DNA Column 套在 2ml 收集管中。把700µl 溶胶液转移至柱子中。12,000 × g 离心 3060 秒。4. (可选: 溶胶液超过 700µl) 倒弃滤液，把柱子套回收集管中。把剩余的溶胶液转移至柱子中。12023 × g 离心 3060 秒5. 倒弃滤液，把柱子套回收集管中。参加300µl Buffer GDP 至柱子中。静置 1 分钟。12,000 × g 离心3060 秒。6. 倒弃滤液，把柱子套回收集管中。参加600µl Buffer DW2已用无水乙醇稀释至柱子中。12,000 × g 离心 3060 秒。7. (可选) 倒弃滤液，把柱子套回收集管中。参加600µl Buffer DW2已用无水乙醇稀释至柱子中。12,000 × g 离心 3060 秒。8. 倒弃滤液，把柱子套回收集管中。12,000 x g 离心 2 分钟。对某些敏感应用(需将大局部洗脱液参加连接反响液时)：翻开柱子的盖子，空气枯燥 1015 分钟以彻底去除乙醇。9. 把柱子套在 1.5ml 离心管中，参加 730µl Elution Buffer 至柱子膜中心。放置 2 分钟。12,000 × g 离心 1 分钟。丢去柱子，把 DNA 保存于-20。假设需要获得最高产量，建议重复第 9 步进展其次步洗脱。回收大于 3KB 以上的片段时，最好把Elution Buffer 预热至 55ºC。六、克隆载体连接与转化试验原理DNA 拓扑异构酶可以在短时间将 DNA 和载体连接构成一个完整的克隆载体。克隆载体上有复制子原件，可以使得载体在大肠杆菌体内进展大量扩增；克隆载体上有选择标记氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗 性等，使得成功转化载体的大肠杆菌可以在具有抗生素的LB 平板上生长。细胞能够从四周环境中摄取DNA 分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特别生理状态称感受态competence。自然环境中细菌可以吸取外源遗传物质以增加自身对环境的适应性。人工感受态的形成，需要低温顺钙处理，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列，Ca2 +与膜上的多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入，外部理化因素促进了感受态的形成。试验材料克隆载体连接试剂盒、大肠杆菌感受态细胞DH5 、LB 液体培育基每升：胰蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g、LB 平板培育基LB+2%琼脂、冰、水浴锅试验步骤组分DNApTOPO-BluntSimpleVector 10XEnhancer体积40.50.51. 组分混合室温下2. 反响程序 室温连接 5 min 3.转化50 l 感受态细胞，置于室温解冻，完全解冻后轻掸几次将细胞均匀悬浮。参加 5 l 连接液，轻轻混匀，冰上放置 5 分钟42水浴热激 45 秒，快速放回冰上并静置 2 分钟 (晃动会降低转化效率)。参加 700 l 不含抗生素的 LB，37，200 rpm 复苏 10 分钟，涂板 (均匀，外表无水渍)。将平板倒置放于 37培育箱过夜培育。七、菌落 PCR 验证试验原理菌落PCRColony PCR可不必提取基因组 DNA，不必酶切鉴定，而是直接以菌体热解后暴露的DNA 为模板进展PCR 扩增，省时少力。建议使用载体上的通用引物和目的基因特异性引物组成的穿插引物。通常利用此方法进展重组体的筛选或者 DNA 测序分析。最终的 PCR 产物大小是载体通用引物之间的插入片断大小。试验材料TaqMix、无菌 PCR 管、ddH2O、PCR 仪、琼脂糖、50XTAE、电泳仪、凝胶成像仪试验步骤1. 无菌PCR 管中参加 2 l 无菌 ddHO，用枪头挑取菌落混匀，取出 1ul 于 LB 平板做亚克隆2. 每个管中参加 12.5 lTaqMix、上下游引物各 1 l、10.5 lddH2O，混匀3. PCR 反响程序循环步骤温度时间循环数预变性953min变性9530sec退火56-7230sec30-35延长7230-60sec/kb彻底延长725min4. 电泳检测并分析结果5. 选取阳性克隆于 5ml 含抗生素的LB 培育基中，过夜培育，送公司进展测序。