单克隆抗体与抗体工程.ppt

单克隆抗体与抗体工程一：细胞融合1：细胞融合技术定义与应用价值n 细胞融合（cell fusion）又称体细胞杂交（somatic hybridization）或细胞杂交（cell hybridization），是指在离体条件下用人工方法将不同种生物或同种生物不同类型的单细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。利用细胞融合技术使不同的细胞融合成一个新的杂合细胞，这个新的细胞就获得了两个亲本细胞的遗传信息和细胞质，从而具备有两个亲本细胞的优点。细胞融合技术的应用价值 n 细胞融合能重新组合两个亲本细胞的优良遗传信息，是研究细胞间遗传信息传递、基因在染色体上定位、改良动物遗传特性、及创造新的符合人类需要的新的细胞系的极为有效的手段。植物细胞融合与人造小鼠培育过程细胞融合过程三个阶段n融合前准备n细胞融合n及融合后的细胞管理融合前准备 n 主要包括细胞培养材料准备、选择免疫动物、抗原及免疫方案设计等；细胞融合 n 一个相对简单的过程，包括骨髓瘤细胞准备、脾细胞分离、融合操作等。n 用于细胞融合的融合剂可以是病毒、化学试剂，或采用电融合技术进行融合。n 在最近的二十多年来，细胞融合技术有了长足的发展，其本身也已成为一们专门的技术在生命科学领域中发挥巨大作用。融合后的管理 n 对融合细胞进行筛选与克隆、优良细胞传代与保存等；细胞融合的关键技术方法n 1）动 物 选 择、免 疫 方 案 设 计、免 疫 途径确定n 2）亲 本 细 胞 准 备、融 合 技 术（条 件、物质手段、融合管理）电融合技术细 胞 克 隆：有 限 稀 释 法（limited dilution technology）和 软 琼 脂 法（soft agar cloning technology）n 3）融合后细胞管理细胞融合技术最有意义的成果之一就是单克隆抗体的制备。n单克隆抗体在生物、农业、医疗、制药等众多领域得到极为广泛的应用；尤其是人源性单克隆抗体制备技术的发展，使单克隆抗体具有更高的实用价值。单克隆抗体技术1：抗体的结构与功能抗体的结构抗体的功能抗原结合活性和特异性（Fab）激活肌体免疫反应（Fc）激活补体系统 介导ADCC、K、NK毒性反应 与激活Fc-R结合 杂交瘤技术原理与过程 杂交瘤技术原理n 利用两种细胞突变株，一株为TK-、HGPRT+，另一株为HGPRT-、TK+。在一般培养条件下，细胞可利用主要途径合成DNA，这些突变细胞能正常生长。当主要途径被氨基碟呤阻断时，这两株细胞不能增殖；如将这两株细胞融合，则只有异核体杂交瘤细胞能在HAT培养基上存活，因为两种细胞相互补充了另一种细胞缺失的酶；而未融合的细胞或自身融合的同核体细胞仍然是而TK-或HGPRT-而被淘汰。杂交瘤技术过程 单克隆抗体的改造与应用1：单克隆抗体靶向技术与 靶向单抗应用 n 单克隆抗体靶向制剂利用抗体的特异性，将药物连接到抗体上，在特定的部位发挥作用的制剂。n 制备方法：与药物直接连接McAb 小分子 药物 大分子 药物应用：特异性溶解血栓药物抗肿瘤药物其它药物2：人源性单抗的制备方法 EBV转化技术 EBV转化-融合技术 嵌合抗体技术 改型抗体技术 噬菌体抗体库技术 EBV转化技术EBV转化-融合技术嵌合抗体技术n 人-鼠嵌合抗体就是用人源性抗体的一部分代替鼠源性抗体的一部分，使之保留对抗原的特异性，又具备与补体和细胞结合的功能，并减少异源性蛋白的抗原性。n 研究人员设想，用人源性基因代替鼠源性抗体基因中的Fc区。因为Fc区的主要功能是激活机体免疫反应，也是产生人抗鼠反应的部分。研究人员利用编码人抗体Fc区的DNA片段替换鼠源性的Fc段DNA。嵌合抗体技术n 嵌合改型抗体 鼠源性抗原决定簇 鼠源性可变区n 人鼠源性抗体高变区人抗体改型抗体技术n 嵌合抗体由鼠可变区与人稳定区组合而成，因而仍有一定的免疫原性。n 为降低来自小鼠可变区中骨架区的免疫原性，Winter等克隆出鼠源抗体中与抗原结合的三个互补决定区（CDR）基因用以置换人抗体中相应序列。n 由于这种抗体绝大部分为人源性，只有CDR区来自小鼠，因而称为CDR移植抗体（CDR grafted antibody）。这种抗体在人体内免疫性大为降低 改型抗体技术 鼠源性基因 人源性基因噬菌体抗体库技术n 将从人或小鼠B淋巴细胞中分离的mRNA逆转录成cDNA，用PCR扩增编码轻链和重链的cDNA；n 然后用限制性内切酶酶解扩增的cDNA片段，克隆到丝状噬菌体质粒载体中，与丝状噬菌体蛋白基因连接成融合基因，经辅助噬菌体感染大肠杆菌后，携带有表达载体的大肠杆菌就会释放外壳上带有抗体片段的噬菌体；n 再用ELISA或免疫亲和层析法筛选出特异性抗体。噬菌体抗体库技术B淋巴细胞分离的mRNA逆转录成cDNAPCR扩增编码轻链和重链的cDNA限制性内切酶酶解克隆到丝状噬菌体质粒载体中感染大肠杆菌释放外壳上带有抗体片段的噬菌体筛选出特异性抗体3：免疫学研究中应用4：医学临床诊断与治疗中的应用 5：生物大分子分离纯化中的应用 细 胞 融 合 技 术 最 有 意 义 的 成 果 之 一 就 是 单 克 隆 抗体 的 制 备。单 克 隆 抗 体 一 在 生 物、农 业、医 疗、制 药等 众 多 领 域 得 到 极 为 广 泛 的 应 用；尤 其 是 人 源 性 单 克隆 抗 体 制 备 技 术 的 发 展，使 单 克 隆 抗 体 具 有 更 高 的 实用 价 值。选 择HGPRT-、TK-、不 分 泌 抗 体 的 骨 髓 瘤 细胞 与 经 抗 原 免 疫 的B淋 巴 细 胞 融 合，用HAT培 养 基 筛 选出 杂 交 瘤，再 经 有 限 稀 释 法 或 软 琼 脂 法 克 隆 抗 体 分 泌阳 性 杂 交 瘤，可 在 动 物 体 内 或 体 外 大 量 培 养 杂 交 瘤 生产 单 克 隆 抗 体。由 于 鼠 源 性 单 抗 在 应 用 上 有 其 固 有 的局 限 性，研 究 人 员 已 采 用 多 种 细 胞 工 程 和 基 因 工 程 方法 制 备 人 源 性 单 抗，以 进 一 步 提 高 单 克 隆 抗 体 的 实 用价 值。虽 然 目 前 人 源 性 单 抗 进 展 不 尽 如 人 意，但 是，细 胞 工 程 与 基 因 工 程 的 结 合，必 将 会 使 单 克 隆 抗 体 进入一个崭新的阶段。