33生物实验的基本技术.pdf

第十三章生物实验的基本技术第一节细胞学实验技术【知识概要】一、玻片标本的制作技术制作玻片标本对认识生物体的形态结构具有重要意义。玻片标本有临时玻片标本（如涂片、压片、临时装片）和永久玻片标本（如永久装片、切片）。1.涂片法涂片法是将材料均匀地涂布在载玻片上的一种制片方法。涂片材料有单细胞生物、小型藻类、血液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精巢、花药等。涂片时应注意：（1）载玻片必须清洁。（2）载玻片要持平。（3）涂层须均匀。涂抹液滴在载玻片中间偏右，用解剖刀刃或牙签等涂匀。（4）涂层要薄。用另一载玻片作推片，沿滴有涂抹液的载玻片面（二载玻片夹角应为3 0 45）由右向左轻轻推动，涂成均匀一薄层。（5）固定。如需固定可用化学固定剂或干燥法（细菌）固定。（6）染色。细菌用亚甲基蓝，血液用瑞氏染液。染色液要盖住全部涂面。（7）冲洗。用吸水纸吸干或烤干。（8）封片。长期保存用加拿大的树胶片片。2.压片法压片法是将生物材料置于载玻片和盖片之间，施加一定压力，将组织细胞压散的一种制片方法。压片法的一般过程：（1）取材。观察细胞分裂，应选取细胞分裂旺盛、新鲜的组织细胞为材料。如根尖、茎尖分生组织、骨髓细胞、花 药（花粉母细胞）。精 巢（精母细胞）等。（2）固定。材料固定可根据需要而定，取材后立即压片观察，可不作单独固定处 理（与染色同步进行）；取材后不立即视察，可将材料用固定液（一般用醋酸酒精固定液）固定。固定224小 时（因材料而异）后用95%乙醇清洗，保存于70%乙醇中，备用。（3）离析。对细胞不易散开材料用水解分离液（如 IN HCI或盐酸一酒精液）处理，一般 处 理 620m in,解离后经水漂洗后方能染色。（4）染色。染色剂种类很多。观察染色体常用醋酸洋红染色液染色。（5）压片。将材料放在载玻片上，加一滴清水或染液，盖上盖玻片用拇指轻轻压片。（6）观察。压片后，即可在显微镜下观察。3.装片法装片法是将生物材料采取整体封固制成玻片标本的方法，用此法可制成临时或永久装片。装片材料有：微小生物如衣藻、水绵、变形虫、水蛆，植物的叶表皮；昆虫的翅、足、口器，人的口腔上皮细胞等。装片法制作时应注意：（1）手持载玻片时，应注意持平，或放在平台上。滴水时水量要适当，以恰好被盖玻片盖满为度。（2）应将材料用解剖针或镶子展开不使重叠，展平在同一平面上。（3）放盖玻片时，从 侧慢慢盖在水滴上，防止出现气泡。（4）染色时，将一滴染色液滴在盖玻片的一侧，用吸水纸从另一侧吸引，使盖玻片下的标本均匀着色。着色后，用同样的方法，滴一滴清水，把染色液吸出后，在显微镜下观察。二、显微镜基本实验技术1 .低 倍 镜（4 X 1 0 X）的使用方法显微镜操作主要包括两个方面：（1）光度调节。正确对光是能否成功地观察到物象的首要条件。对光时，先把聚光器上提，打开可变阑，转动反光镜，这时一边看镜内视野，一边调节聚光器螺旋，直至视野内得到均匀而明亮的光线。（2）焦距的调节。调焦时，先把观察的切片，用推进器对正通光孔中央。然后分两步调焦。先用粗调器定焦，用左眼看目镜，使粗调器慢慢上升，直到能清楚地看到标本为止。随后调节细调器，使镜筒微微升降，至物象更清晰为止。2 .高 倍 镜（4 0 X）的使用方法（1）将在低倍镜中找到的物象欲放大部分移到视野中央。（2）转动物镜转换器，使4 0 X物镜对准通光孔，转动时从侧面注视物镜，以防镜头紧压玻片。（3）调节细调螺旋，使物象清晰。3 .汕 镜（1 0 0 X）的使用方法（1）先用低倍镜找到欲观察细微结构，将其结构移至视野中央换高倍镜。（2）下降镜台，在玻片标本上滴一滴香柏油，转换油镜。从侧面注视油镜，把镜台上升，使油镜头浸在香柏油滴中。（3）转动细调螺旋，使物象清晰，进行观察。（4）观察完毕，用镜头纸擦去油镜头和玻片上的香柏油，再用少许二甲苯或乙酸/无水乙醇把镜头擦干净。4 .安装指针的简易方法将目镜的上盖（一片透镜）旋下，剪取一小段头发（其长度约等于目镜的半径），用锻子夹住一端，将另一端蘸少许中性胶，将其粘在目镜内壁的金属光栏（一铁圈）上。稍干后，旋紧上盖，即可使用。三、单细胞的计数方法在细菌培养和体外细胞培养，以及环境监测血液检查中常常需要统计细菌、细胞、单细胞藻类、原生动物、血细胞、花粉等数量。细胞计数方法的原理是把一定体积的细胞液体，在显微镜下直接计算其个数，利用所得结果推算出每毫升水体中的单细胞数。具体方法如下：1 .水滴计数法用管口圆而平滑、大小适宜的吸管，吸 取1 m L水，然后测定这一吸管I r n L水可滴出多少滴水（反复测定，直到准确为止）。这样可以计算出该吸管滴出的每一滴水的体积。用吸管取样时，如果单细胞是活动的要用碘杀死后，再计数；如果样品浓度太大，计数困难，按倍数稀释到适宜的浓度；另外，取样前必须搅拌，搅拌后，立即取样。取样后，在显微镜下计数，得到滴水中细胞数的平均值后，可依下列公式求出1 m L水体中所含细胞的数目。1 m L水体中含细胞数=计数平均值又定量吸管每毫升的滴数X稀释倍数2 .血球计数板计数法血球计数板是由块厚玻片特制而成，其中央有两个计数室。每个计数室划分出9个大方格（见下图），每格面积Im n?,加盖玻片后的深度为0.1mm。因此，每大方格容积为0.1mm。另外，中央大方格以双线等分为25个中方格。每个中方格又分16个小方格，供细胞计数用。.f 尸 匕=计粒板计数室盖玻片2ASKfc 以秀段鹤 JOB9U 门 桃Q iV fcl4il川1用|巾甘用朋1塞!9川 Ctffttf,0 ，由H5疝 (X4如 !134血球计数板的构造1.顶 面 观2.侧 面 观3.放 大 后 的 网 格4.放大后的计数室计数方法：首先用吸管吸取少许稀释倍数的单细胞悬液，从盖片端滴一小滴（不宜过多），液体自行向内渗入，静置数分钟后，再放在微镜下观察计数。一般选取计数室内四个角及中央五个中方格（80小方格）计数，若细胞位于小方格的线上，应遵循“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则，以减少误差。计数应重复3次，取其平均值。数完毕后，依下式计算：每1mL悬液细胞数或每克细胞数=8 0个小方格细胞总数/80 X 400X 10000X稀释倍数四、显微测微尺的应用方法显微测微尺是在显微镜下测量生物细微结构的测微工具，用它测量细胞各部分的厚薄和大小。显微测微尺（见下图）包括目镜测微尺（目尺）和物镜测微尺（台尺），测量时须将其配合使用方可达到测量目的。目镜测微尺为一圆形玻片，玻片中央有一-横线刻有大小格的等距离线。物镜测微尺有一特制的玻片，中央圆圈内有一 1mm长 分 为100个等距小格的刻线，每一小格即10 u m。显微测微尺测量方法：首先须算出目镜测微尺的每一格在不同倍物镜下各为多少Um。即取下接目镜卸下透镜，装上目镜测微尺。然后将物镜测微尺放在镜台中央，眼观目镜，调好焦距，使两种测微尺上的刻度平行并重叠在一起。按下面公式计算出目镜测微尺每格的实际长度。目镜测微尺每格的长度（um）=物镜测微尺的格数/目镜测微尺的格数X 10计算出目镜测微尺每格的实际长度后，再在镜台上放上需要测量的物体标本或玻片标本，即可用目镜测微尺测出它们的长度。五、显微结构图的绘制技巧生物绘图是科学记录的 种方法。绘图忖应注意：（1）绘科学图以精确为主，不能艺术加工渲染。（2）只在纸的一面绘图。绘图时要用2H 以上绘图铅笔，纸面力求整洁。（3）绘图大小适宜，布局合理。一般要求图画在纸的稍偏左侧，留出图注的位置。（4）图的各部分的位置和比例，应与显微镜中实际观察的一致，而要注意突出显微结构的每个特征。（5）显微构造图的点线不要重复描绘。以实线表示轮廓，虚线表示被遮蔽但需表现的轮廓，用圆点的疏密来表示明暗、凹凸等层次。点点时笔尖直立。点的大小、疏密要均匀、整齐、浑圆。（6）绘图时，般先草拟轮廓图，经检查无误后，再以准确、清晰的线作最后的描绘。【解题指导】例 1用显微镜观察洋葱根尖细胞的有丝分裂，要看清各时期细胞内染色体的变化情况，目镜、物镜的合理搭配应该是_ _ _ _ _A目 镜（24X）、物 镜(10X,N A0.25)B目 镜（5X）、物 镜(40X,N-A0.65)C目 镜（10X）、物 镜(40X,N A0.65)D目 镜（24X）、物 镜(40X,N-A0.65)析 此题属镜像亮度问题。镜像亮度与物镜镜口率（NA）平方成正比，与总放大倍数成反比。由此，在总放大倍数相同情况下，要使物像亮度增加，应该使用高镜口率（NA）的物镜与低倍目镜配合，根据这一原理应选择C。例 2在观察显微镜时，经常遇到以下5 种现象：（1）视野亮度晃眼；（2）视野不圆；（3）对光时视野中出现窗根、树影等物现象；（4）只见视野不见图像；（5）图像结构不完整，试分析出现这些现象的可能原因，并提出排除方法。析（1）视野亮度晃眼，可能原因：反光镜直射强光源；光照到通光孔上缘。排除方法：用平面镜斜对光源；挪镜。（2）视野不圆的可能原因：遮光器或转换器没有转到头；遮光器或转换器螺丝动。排除方法：把两者转到头（弹簧片入槽）;拧紧螺丝。（3）对光时视野中出现其他物象，其可能原因是镜筒太高或太低，调节一下镜筒即可消除。（4）只见视野不见图像，可能是操作不仔细，低倍镜头偏于一旁。排除方法：将低倍镜头对准通光孔。（5）图像结构不完整的可能原因是未根据材料的不同折光性用光，应调节光圈使透明度一致。例 3某架显微镜由于磨损，低倍镜上的放大倍数看不清，而高倍物镜尚看得出是40 倍，借助实验台上的哪些材料可帮你测出低信镜的放大倍数？说明测定方法。（实验台上有显微镜、目镜测微尺、物镜测微尺、刻度尺、放大镜）析 此题可利用显微测量技术测定。利用实验台上的显微镜和测微尺进行测量。由于目镜测微尺每格的实际长度因不同物镜的放大倍数有所不同，因此可以在相同目镜下，测量变换高（40X）、低倍物镜下的视野直径，由于放大倍数与视野直径成反比，按下式计算即可求出低倍镜的放大倍数。高倍镜放大倍数/低倍镜放大倍数=低倍镜视野直径/高倍镜视野直径例 4在一黄粉岬幼虫尾部4 5 节的节间刺一针，用毛细吸管取1 4mL血淋巴，再用毛细吸管取15 20mL生理盐水，用血球计数板计细胞数（区别脂类颗粒、组织碎片与细胞），计算血淋巴细胞浓度填入下表。30min重复一次（针刺部位前移一体节），60min重复一次（针刺部位再前移一体节）。（1）将有关数据填入下表:时间间隔（min）血淋巴长度（a）mL生理盐水（b）mL细胞数（数 25个中方格）细胞密度（个/m L）03060（2）将细胞W 首度变化绘成u 由线，并回答下列问题：计数时怎样处理压线细胞？用一句话回答。给出计算细胞密度的公式。用一句话回答为什么血盖片较一般盖玻片厚。（注意：针刺幼虫时;食指与中指夹住头部，拇指按住尾部，使其不动。针刺不要过深，不要挑动，以免虫死亡或使头部器官的细胞或杂物进入血淋巴。虫不可死。）析 此题按血球计数极计数的方法操作，所得数据镇入表中。根据绘制函数曲线原理，以时间间隔为横坐标，细 胞密度（个/m L）为纵坐标，绘制曲线。在计数时，对压线细胞采取“数上线不数下线，数左线不数右线”的原则处理。计算细胞数方法：每 mL悬液细胞数=8 0 个小方格细胞总数/80X400X 10000X稀释倍数血盖片比普通盖玻片厚是因为要盖住计数板上的计数室沟槽。【巩固练习】1.某同学在做观察洋葱根尖细胞有丝分裂装片时，有两次出了差错。第一次是解离时间为2min,第二次是60min。请你推出实验结果并说明原因。第一次是因,所以观察到的是 o 第二次，则因,所以 02.在照明充分的情况卜，在显微镜视野内可看清洋葱鳞茎表皮细胞无色的细胞壁,但看不清液泡，为了能显示细胞质与液泡的界面，此时应A改用凹面反光镜，放大光圈 B改用凹面反光镜，缩小光圈C改用平面反光镜，放大光圈 D改用平面反光镜，缩小光圈3.在显微镜视野中观察玻片标本，物镜测微尺和目镜（5X）测微尺在0 点处重合时，物境测微尺的80格与目镜测微尺的55格处也相重叠时，试问目镜测微尺一格的长度是 Um；如观察测量某种植物的细胞大小时，测量其长为7 个小格，那么此细胞的实际长度是4.撕取所给叶片的下表皮，放在显微镜下观察，绘出保卫细胞及表皮细胞的特征。随机取五个视野计算气孔数，取其平均值，计算气孔密度（个/c n/）。（低倍物镜视野直径为1.5m m,目镜统一用10倍）第 二 节 物理学和化学分析技术【知识概要】一、分离技术分离技术主要是利用物理学和化学的原理建立起来的各种分离、纯化方法。常用的分离技术有以下几种：1.纸层析法层析技术是从一个混合物中分离和纯化一种或几种生物化合物的最简便的方法，用滤纸为支持物的层析法，叫纸层析法。纸层析用的展层溶剂大多由水和有机溶剂组成。滤纸纤维与水的亲和力强，与有机溶剂的亲和力弱，因此在展层时，水是静止相，纸是静止相的支持物，有机溶剂是流动相，它沿着滤纸流动。若将生物样品（提取液）点在滤纸上（此点称为原点）进行展层，样品中的各种溶质（如叶绿体中的四种色素，各种氨基酸等）即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同，不同溶质随流动相移动的速率不等，于是就将这些溶质分离开来，形成距原点不等的层析点。纸层析的具体方法：（1）制样。将样品经研磨、过滤制备成提取液；（2）制备滤纸条。将滤纸剪成长10cm,宽 1cm的纸条。在一端用铅笔画一横线（点样线）；（3）点样。用毛细吸管将滤液沿点样线画一直的滤液细线；（4）层析：将层析液（石油酸、丙酮、苯的混合液）倒入烧杯，然后将滤纸条靠烧杯内壁轻轻插入层析液中。（5）结果。几分钟后，出现层析现象。2.电泳法电泳技术主要是根据不同物质所带的电荷的数量和性质不同，因而在电场移动中的速度和方向就不同。生物分子如氨基酸、多肽、蛋白质、酶和核酸等都具有可电离的集团，在溶剂中能形成带电荷的分子，由于在不同的溶剂介质中所带的电荷的数量和性质的差别，在电场中泳动的速度（迁移率）不同，由此可以分离各种物质成分。电泳的方法很多，有纸电泳、琼脂平板电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，其中较简单的是纸上电泳法，它是用滤纸作为电泳载体的一种电泳方法。纸上电泳一般操作过程（以分离血清蛋白为例）：（1）仪器准备。电泳设备主要是电泳仪和电泳槽（见下图）。电泳槽是供两极电泳分离和盛装缓冲液之用。电泳仪提供可控电源。一般采用电压在100500V,电流在0mA50mA或 100mA。（2）配制缓冲液。缓冲液的种类很多，可用0.5M、pH5.6巴比妥缓冲液或Ph8.6硼酸缓冲液。缓冲液配好后直接加入两侧电泳槽中。（3）裁剪滤纸。取电泳滤纸，按 2X20cm剪裁，于一端约 1/3处用铅笔划点样线，将纸用缓冲液浸湿。（4）点样。在点样线上，用 50 H L微量注射器点样，一般为10mL。点样后，将滤纸放在电泳槽两极隔板上，两端浸入缓冲液中。（5）电泳。接上电源，按滤纸长和宽选用电压（8V/cm）和 电 流（0.4m A/cm）,以点样线一侧为负极，向正极泳行。（6）烘干。取下电泳纸条在烤箱（90105）迅速烘干。（7）染色。将烘干滤纸条浸入浪酚兰染液lO m in,取 出 以 0.5%醋酸溶液脱色，逐渐显出电泳带。（8）比色。将各条区带滤纸剪下，以电泳空白滤纸为对照，在分光光比色计上比色。（9）计算。按光密度值计算出各部分蛋白质的百分数。水平电泳槽装置3.离心法离心法是一种利用物质在溶液中的密度、大小和形状的不同，以及它们沉降系数、质量、浮力因子等方面的差别，通过强离心力的作用使其分离、浓缩、提纯的技术，并可用于分子量的测定。在生物学研究中，常用离心方法从组织匀浆中分离各种细胞器及各种蛋白质、核酸等生物大分子。离心的设备主要是离心机，它是利用离心力对混合液进行分离和沉淀的专门仪器。离心机的种类很多，有低速离心机（4000 Y/m in以下）、高速离心机（4000 Y/m in以上,20000 Y /m in以下）和超速高心机（20000 Y/m in以上）。离心分离方法很多，常用的是差速离心机，是指低速和高速离心交替进行，用不同强度的离心力使不同质量的物质分批分离的方法。例如，利用离心机的不同转数（rpm,即 Y/min）和时间，从鼠肝匀浆中分离各种亚细胞组分的过程（下图）：细胞核沉淀在O.25M蔗澹中的肝匀浆|3700rpn 离心 10 min沉 I-0.25VI蔗糖洗3700ipm 离心 lOhin上清液合并上清液沉淀+绒毛层-0.25M蔗糖洗线粒体+绒毛 6800rpm离心lOnin层沉淀-6800mn 离心 IQrin-上清液合并-上清液溶酶体沉淀微粒体沉淀沉淀-(O.25M蔗糖洗15000rpm 离心 20rrrin1500fttpm 离心 2(knin上清液+绒毛层|合并上清液+绒毛层34000rpm 离心 3(han-最后的上清液大白鼠肝脏匀装分级分离各种亚细胞组分图解二、测定技术1.定性测定比色法生物材料化学成分的测定技术很多，在生物学实验中最常用的简便方法是比色法。比色法是利用生物组织中的有机物与某些化学试剂相互作用，能产生颜色反应的原理，可以根据颜色反应鉴定生物组织中某种有机物的存在。从细胞组织中，鉴定有机物的常用比色法，参见下表。成分试剂作用颜色反应还原糖斐 林(Fehling)试剂使自由醛或酮基的糖氧化产生棕红色Cu2O沉淀蛋白质双缩服试剂肽锭在碱性环境中与CuSC)4结合产生红紫色的络合物淀粉碘液淀粉与碘结合蓝色反应脂肪苏丹in酒精溶液脂肪与苏丹HI结合红色反应维生素A三氯化镭一氯仿溶液与SbC13作用蓝色反应维生素B,重氮化氨基苯碳酸溶液在碱性溶液中发生作用红色反应核酸亚硫酸复红溶液与D N A发生作用呈红色或紫色2.定屋二测定滴定法滴定法是将一定浓度的标准溶液滴入被测物质溶液中，当反应到终点后，根据所用标准溶液的体积计算被测物质的含量，这是一种常用的容量分析法。滴定法常用的仪器是滴定管。它是带有刻度和活栓的玻璃管，用它放送已知体积的溶液。滴定法的一般操作技术(以维生素c 定量测定为例)：(1)样品制备。将样品(洗净蔬菜)2 0 g,加 2%草 酸 100g,置组织搅拌机中打成浆状。称取5g浆状物倒入50mL容量瓶中以2%草酸溶液稀释至刻度。静 置 lO m in,过滤备用。(2)滴定。标准液滴定：准确吸取标准抗坏血酸(V c)溶 液 1mL(含 O.lmgVc)置 100mL锥形瓶中，加 9Mli%草酸，微量滴定管以0.1%2,6-二氯酚靛酚滴至淡红色，并保持15sec即为终点。由所用染料的体积计算出1mL染料相当于多少m g抗坏血酸。样液滴定：准确吸取滤液两份，每 份 10mL分别放入两个100mL 锥形瓶内，测定方法同前。计算：VX T/W X 100=100g样品中含抗坏血酸(Vc)m g数式中：V=滴定时所用去染料毫升数。T=1mL染料能氧化V c毫克数。W-10mL样液相当于含样品之克数。【解题指导】例 1叶绿体中色素的提取和分离：(1)提取和分离叶绿体的色素，可采用 方法。(2)用毛细吸管在滤纸上划出滤液细线时，线条越细越好，这 样 可 以 避 免,以便取得较好的 o(3)叶绿体b 为黄绿色，层折后的位置是在滤纸条的 o(4)实验应尽量在通风处进行，实验后一定要将手洗净，这是因为。析 提取和分离叶绿体中的色素可采用纸层析法。在点样划线时，越细越好，这样可避免色素带之间部分重叠，以便取得较好的分离效果。层析后，滤纸条上自上而下有4 条色素带。因为该实验使用了苯、丙酮等有毒化学药品，实验时应通风，实验后要洗手，确保安全。例 2在鸡血DNA的粗提取与鉴定实验中，请回答：(1)为什么使用NaCl溶液离析 DNA?(2)为什么使用乙醇纯化DNA?(3)为什么甲基绿能鉴定DNA?析DNA在 NaCl溶液中有一定的溶解度，并随着NaCl溶液的溶度变化而改变。当 NaCl的质量浓度为0.14M/L 时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可促使溶解在 NaCl溶液中的DNA析出。DNA不溶于乙醇，但细胞中的某些物质可以溶于乙醇。利用这一原理，可以进一步取出较纯净的DNA。DNA遇甲基绿会被染成蓝绿色。因此,甲基绿可用作鉴定DNA的特定试剂。例 3利用纸电泳法分离血清蛋白。已知血清蛋白中含有5 种蛋白质，依分子量由小到大排列为清蛋白A、a 、a 2,8、Y球蛋白。试问：(1)电泳后，滤纸上出现几条区带？离点样线最远者是什么蛋白质？说明其原因。(2)欲计算各部分蛋白质的百分数，请说明计算方法。析：电泳后，在滤纸上应出现5 条区带，因为分子量小的蛋白质，电场中泳动的速度快，也就是迁移率大。因此，离点样线最远者为清蛋白A,依次是a1、a2,6、Y球蛋白。计算各蛋白质的百分数，可通过比色法测定，在分光光电比色计上对各条区带进行比色，波长在580nm 600nm,记录各自的光密度。然后按光密度总和T=A+a+a 2+B+丫的各光密度值，计算出各部分蛋白质的百分数：清蛋白 A%=A/TX 100；球蛋白 a%=a I/TXIOO其他蛋白质依次类推。【巩固练习】5.在实验台上有天平、100mL烧杯、培 养 皿(6 个)、红墨水、k-KI溶液、苏丹III溶液、双缩胭试剂、显微镜、刀片、镒子、小麦种子、菜豆种子、蒐麻种子(将以上种子分出一半浸泡使部分种子刚好发芽，然后将每种种子浸泡过的和干燥的分别装于培养皿中)。试问：(1)绘图说明培养皿中各种材料各部分的结构名称。(2)测定各类种子萌发所需的吸水量(g 水/g 种子)，并写明实验过程。(3)测定各类种子潜在的萌发率(%),并写明实验过程。(4)各类种子贮存有机物有何特点？依据是什么？6.研磨叶肉细胞后放入离心管中离心，细胞壁和核物质沉淀在管底，这些沉淀物为 P”上清液为舟。将与倒入另一管离心，分离出椭球或球形颗粒P?和上清液S2。将S2再倒入另一离心管离心，分离出棒状的颗粒民P3和上清液S3。再将S3倒入另离心管离心，分离出上清液S4和含粒状小体的沉淀物P4。而 S4中只含有溶解于水的物质。(见下图)。A P,B P2 C P3 D P4 E S4(1)合 成 蛋 白 质 的 结 构 存 在 于。(2)DNA含 量 最 多 的 是。(3)含有将CO2和 H2O 合成C6Hl2。6的反应所需酶的是 o(4)含 有 将 葡 萄 糖 分 解 成 酒 精 的 反 应 所 需 酶 的 是。7.用碘液、乙醇、苏丹m 溶液、盐酸液、氢氧化钠溶液、硫酸铜溶液、氯化钾溶液、醋酸洋红溶液、亚甲基蓝溶液、丙酮等药品，如何证明面粉用用纱布包起来在清水中搓洗后，纱布中的面筋是蛋白质？洗出来的白浆是淀粉？8.将花盆横放在转盘上，若转盘以最大速度旋转时，花枝朝什么方向生长？并说明其原因？9.用小刀将数十只萤火虫发光器割下，干燥后研成粉末状，取两等分分别装入两只小玻璃瓶中各加入少量的水，使之混合，可见到玻璃瓶中有淡黄色荧光出现，经过15min荧光消失。这时，再将ATP溶液加入其中只玻璃瓶中，将葡萄糖溶液加入另一只玻璃瓶中，可观察到加ATP溶液的玻璃瓶中荧光出现，而加葡萄溶液的瓶中没有荧光出现。以上现象说明了(1)；(2)；(3)。第三节微生物培养技术【知识概要】一、培养基的制作技术制作培养基是微生物实验的基础。培养基的制作有以下几个环节：1.玻璃器皿的清洁在制作培养基前，首先应准备好合乎要求的清洁玻璃器皿。一般用肥皂液煮沸30m in,或浸入用重倍酸钾和浓硫酸配制的洗液数lO m in,然后用清水冲洗，晾干后保存备用。2.培养基的制作过程(D 配制液体培养基根据需要配制培养基的数量，先在大杯中注入部分蒸储水：按培养基配方称量各种成分的原料，依次加入使之溶解；补足需水量；如用肉膏等配制时，需加热溶解；加热后，补足因加热所蒸发的水分，即成液体培养基。(2)配制固定培养基 在液体培养基里加凝固材料(琼脂)，加入后继续加热使之融化，即成固体培养基。(3)调 整 pH值 配好培养基后用pH试纸测试，用 10%HC1或 10%NaOH调到所需的pH。(4)过滤分装用滤纸或纱布趁热过滤，将过滤液分装于试管中，其量约为试管的 1/41/3(不要沾污管壁)，塞上棉塞。(5)灭菌将分装好的培养基，经高压蒸汽灭菌30m in,保存备用。3.制平面或斜面培养基在分装时，如装入培养皿则成平面培养基。欲制成斜面培养基，则将灭菌后的琼脂培养基，趁热倒入试管，盖上棉塞，并将试管摆放在小木条支架上，呈适当斜度(见下图)，凝固后即成斜面培养基，可保存备用。培养基的斜面摆法4.细菌培养基的制法培养不同的微生物需制备不同的培养基。培养细菌主要用牛肉膏培养基（牛肉膏0.5g；蛋白膝1g；食盐0.5g；琼 脂 1.5g；水 100mL）。制法是：按照配方先配好各种成分的培养液，加热使之充分溶解，并补足所失水分。调 pH 为 7.47.8（灭菌后的pH 为7.27.6）。分装后灭菌，制成斜面，即成肉膏蛋白陈培养基。二、分病菌技术分离菌技术主要包括接种和稀释技术。微生物的各项实验操作均应在无菌条件下进行。1.接种技术（1）接种设备 接种时可在无菌操作箱（见下图）或超净工作台上操作。无此设无菌操作箱1.通气孔：2.移动门：3.手孔（2）接种的方法步骤 用品的消毒灭菌。接种箱和接种用品用紫外灯灭菌。双手用75%乙醇消毒。采种。菌种由窗门放入，两手从袖套伸进接种箱，点燃酒精灯，用左手并排拿起有菌种的试管和培养试管，试管口靠近酒精灯火焰，旋松棉塞；右手的拇指和食指拿起接种环，放在火焰上烧红灭菌。接种。用右手的中指、无名指和小指夹下两个棉塞，把两个试管口放在火焰上燎一下。把灭菌的接种环伸进菌种试管，挑取一点菌落，再插入培养基试管里，在培养基斜面上由管底向管口连续轻轻地划几道曲线,使菌落涂在培养基上。然后抽出接种环，将试管口再在火焰上燎一燎，塞上棉塞，连续操作使所有培养基试管都涂上菌落。（参看下图接种方法示意图）保温培养。接种后，将试管放保温箱3 7 c恒温培养，3 4 天后，在培养基上可以看到正在发育的菌落。接种方法示意图1.接种环灭菌；2.采种；3.接利，；4.试管口灭菌；5.装好棉塞2.稀释技术在自然界，微生物都是混杂生活在一起的，要想研究某种细菌，必须从混杂的细菌群体中分离得到一种细菌。这种纯培养分离菌种的方法很多，较简单的有稀释倒平皿法。这种方法是将待分离的材料作一系列稀释（如 1 ：10、1 ：100、1：1000、1 ：10000等）,取不同稀释液各少许与一溶化并冷却至45的琼脂培养基相混合，倾入灭过菌的培养皿中，待培养基凝固后，保温培养一定时间，即有菌落出现（如下图）。如果稀释得当，平皿中出现分散的单个菌落便可能由一个细菌繁殖而成，挑取此单个菌落或再重复以上操作数次，便可得到纯培养的菌株。稀释倒平皿分离法鉴别细菌主要采用革兰氏染色法。按照细菌对这种染色反应的不同，分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。染色方法要点是：细菌先经草酸结晶紫染色处理，用媒染剂（碘液）处理后，再用酒精脱色，最后番红或沙黄复染。如果细菌不脱色不复染，呈紫色，称为革兰氏阳性细菌（用 G 表示），如芽泡杆菌、放线菌、酵母菌和多数球菌呈阳性反应；如果细菌被酒精脱色而被番红或沙黄复染成红色的称为革兰氏阴性细菌（用G-表示），如大多数无芽抱杆菌和某些球菌、螺旋菌，呈阴性反应。【解题指导】例 1现提供以下实验条件：显微镜一台、革兰氏染色用具一套、血球计数板一套、吸管、小烧杯、天平、测微尺一套、试管、吸水纸、二甲苯、香柏油。请进行下列实验并回答问题。（1）请设计一实验来判断：成型颗粒样品A o该样品可能含有何种生物细胞？该成型颗粒样品A中生物细胞含量为多少？（个值）若该成型颗粒全为生物细胞组成，试求出每个细胞的重量？（要求写出实验过程、所用器材，测定的数据、计算公式、结果等）（2）有 材 料 C,请对其进行革兰氏染色。判断该细菌为何形态？染色结果如何？绘出该细胞的形态图？（要求同上）析（1）实验提供的样品A为市售干性活酵母。先将定量样品A用定量无菌水稀释成菌液，然后用革兰氏染色法鉴别该菌的类型并在显微镜下识别该菌的形态。实验结果呈革兰氏阳性反应，再根据形态说明该样品可能是酵母菌。通过显微测量，用血球计数板测定样品A的细胞含量（个/g）和每个细胞的重量（g /个）。（2）材料C为短杆菌。通过革兰氏染色后，在油镜下观察细胞的形态，并绘出该细胞的形态图。例 2 将 1 0 m L 酵母液放在适宜温度下培养，并于不同时间内等量均匀取样4次，分别测定样品中酵母菌的数量和p H,结果如下表。请分析回答。（1）表 中 样 品 的 取 样 先 后 次 序 为。样品酵母菌数量（个 胸）PH112104.828205.4312103.7410005.00.05 说明“差异不显著”，P 0.05 说明“差异显著”，如果P V 0.0I说 明“差异极显著”。有了 X 2值和自由度（用 d f 表示，d f=k-l,k 为类型数），就可以通过下表查出P值，确定实验结果是否与理论预期值相符合。不同X?值和不同自由度的P值23456789100.990.950.900.800.700.500.300.200.100.050.010.00016 0.04 0.016 0.064 0.148 0.455 1.074 1.642 2.706 3.841 6.6350.0201 0.103 0.211 0.446o.?d1.386 2.408 3.219 4.605 5.991 9.2100.115 0.352 0.584 1.005 1.424 2.366 3.665 4.642 6.251 7.815 11.3450.297 0.711 1.064 1.649 2.195 3.357 4.878 5.989 7.779 9.488 13.2770.554 1.145 1.610 2.343 3.000 4.351 6.064 7.269 9.236 1I.07Q15.0860.872 1.635 2.2043.0703.828 5.345 7.2318.58810.645 12.592 16.8121.239 2.167 2.833 3.822 4.671 6.346 8.783 9,803 12.017 14.067 18.4751.646 2.733 3.490 4.594 5.527 7.344 9.524 11.030 13.362 15.50720.0902.088.325 4.168 5.380 6.393 8.343 10.656 12.242 14.684 16.91921.6662.558 3.940 4.865 6.179 7.627 9.342 11.781 13.442 15.987 18.307 23.209【解题指导】例 1 3 支试管内分别装有红眼雄性和两种不同基因型的红眼雌性果蝇，还 有 1 支试管内装有白眼果蝇。请利用实验室条件设计最佳方案，鉴别并写出上述3 支试管内果蝇的基因型（显性基因用B 表示）。析 先选择第二性征鉴别4支试管内果蝇的性别。若为红眼雄性果蝇，则该试管内果蝇基因型为X BY：再用白眼雄性果蝇分别与另2 管的红眼雌蝇交配；若后代中出现性状分离，则该管中果蝇的基因型为XBXb；若后代中不出现性状分离，则该管中果蝇的基因型为X BX B。例 2在番茄中真实遗传的紫茎、缺刻叶植株（A A C C）与真实遗传的绿茎、马铃薯叶植株（a a c c）杂交，F 2 结果如下：紫茎缺刻|十紫茎马铃薯叶绿茎缺刻叶绿茎马铃薯叶2 4 79 08 334（1）在总共4 5 4 株 F 2 中，计算4种表型的预期数。（2）进行X2 测验。（3）问这两基因是否是自山组合的？析（1）按基因的自由组合规律，两对相对性状条本杂交，F 2 的 4种表型分离比应为9 ：3：3：1,这样4种表型的预期数应为2 5 6 ：8 5 ：8 5 ：2 8。（2）按上 e=5 4.6 计算，自由度为3（d f=4-l=3）,查 P值表，P P 2、F 、F 2 果穗的X、Sx 是多少？从 X 和 Sx 计算结果说明什么遗传现象？（2）比较R与 F 2 标准差之间的差异，你认为这种差异是否显著？（3）试分析控制玉米穗长的基因有多少？析（1）根据公式计算：短穗亲本P,的平均穗长为6.6 c m,标准差为0.8 1 6 c m；长穗亲本P 2 的平均穗长为1 6.8 c m,标准差为1.8 8 7 c m；F 1 的平均穗长为1 2.1 c m,介于两亲之间；F 2 的平均穗长为1 2.8 8 8 c m,与 F 1 的平均长度相近,但F 2 的标准差2.2 5 2 c m 比B的标准差1.5 1 9 c m 大，说明F 2 的变异幅度大。（2）F?与 F|标准差的相差：2.2 5 2 c m-1.5 1 9 c m=0.7 33c m 这种差异是否显著，需计算它们的标准差的机误：E标准差的机误：F 2 标准差的机误：E与 F z标准差相差的机误：0.1 5。由于F 2 与 H的标准差的相差是它的机误的4倍以 上（0.7 33/0.1 5=4.8）,这个差异说明F?与 E之间的差异是显著的。（3）根据估计数量性状基因数目的公式计算：依立式求出最少基因数为5。【巩固练习】23.有两群果蝇，一群为4 0 只，其中雄的3 0 只，雌 的 10只，另一群200只中，有雄果蝇90只，雌果蝇110只，如果按理论推算，雌雄比例应为1 ：1。从实际情况看,两群的雌雄比例都与理论预期数值有偏差，这种偏差是山于实验本身存在的问题呢，还是由于机会造成的呢？试分析偏差的原因，并写出计算根据。24.为验证孟德尔的分离规律，进行抛人民币的硬币实验：（1）拿一个硬币向空中抛去，落下来时，出现字面向上或画面向上的几率是多少？这现象可以说明孟德尔规律中哪个原理？（2）拿两个硬币同时抛，落下来时，出现甲、乙两个硬币全是字面向上或画面向.上的儿率是多少？甲硬币为字面、乙硬币为画面的几率是多少？这种现象可以说明孟德尔规律的哪个原理？25.1996年英国的两位学者贝特森（Bat。）和潘耐特（Pannett）在研究香豌豆（Lathyrus odoratus）两对性状（花的颜色和花粉粒的形状）遗传时，获得了以下杂交结果：P（亲本）：紫花、长花粉和红花、圆花粉；Fl：全部为紫花、长花粉；F2：紫花、长花粉 4831株，紫花、圆花粉390株，红花、长花粉393株，红花、圆花粉1338株。试用X2测验说明这一实验结果是否符合孟德尔独立分配规律？你认为发生这种现象的可能原因是什么？26.在果蝇的杂交实验中，白眼的雌蝇和红眼的雄蝇交配，子 代的雌蝇全属红眼，但 是（杂合的）子一代的雄蝇全是白眼。子二代在每个性别中红眼和白眼各占1/2。又如红眼雌蝇配白眼雄蝇则子一代全为红眼，子二代雌的全为红眼，雄 的 1/2 红眼，1/2白眼。试问这种遗传现象是否符合孟德尔规律？说明其原因。第七节生态和环境考察技术【知识概要】一、种群密度的测定技术种群密度是指单位空间内某种群的个体数量。在对动植物种群密度的调查中，一般采用样方法，即在被调查种群的生存环境内，随机选取若干样方，通过计数每个样方的个体数，求得每个样方的种群密度，以所有样方种群密度的平均值作为该种群密度。1.双子叶草本植物种群密度的测定方法（1）确定调查对象。根据当地实际情况确定某一地段中的某种双子叶植物的种群（如苦卖菜、蒲公英、葬等）为调查对象。（2）选取样方。选择一个该种群分布较均匀的长方形地块，将该地块按长度划成10等份，在每份的中央划一 个长和宽各为1m的正方形样方。（3）计数。计数各个样方内该种群的数量，做好记录。（4）计算种群密度。计算各样方内种群数量的平均值和标准差，这个数值就可以作为该种群的群密度的估计值（单位为株/m2）.2.昆虫种群密度的测定方法（1）选择样方。选择一块几十至几百n?的野外隔离空地，如菜田或草坪。（2）取样。从地块边上某一点出发，山一名操作者手拿捕虫网按蛇形取样法左右扫网捕虫，分类到目，记录数目，最后处死昆虫。每走一遍捕得的昆虫总数即为一次捕获数。（3）重复取样。每间隔5 分钟，按原取样路线，以相同扫网次数进行捕虫，记录数目。当捕获数量呈连续下降趋势时，即可以停止。（4）计数。