脑脉络丛中锰毒性蛋白的鉴定验证及锰致细胞周期阻滞的调控机制.docx

脑脉络丛中镒毒性蛋白的鉴定验证及镒致细胞周期阻滞的调控机制李国君敬海明I董一文I魏开华2,杨帆2,刘君丽I刘羽I马玲】，赵超英I刘建中I郑珊，高文晖I谭壮生I李煜I李明）焦智浩1.北京市疾病预防控制中心/北京市预防医学研究中心，北京市食物中毒诊断溯源技术重点实验室，北京，1000132.北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，北京，102206*:通讯作者：李国君目的：慢性镒中毒的脑实质病理损伤具有不可逆性，但早期诊断和防治目前尚难实现。位于第三、 四及侧脑室的脉络丛（choroid plexus, CP）是构成血-脑脊液屏障的主要组织，是镒神经毒性作用的 中间环节，其上皮细胞受损后在锯中毒发病过程中起关键作用，但其毒性机制不详。本研究从动物 整体水平和体外细胞水平，应用差异蛋白组学技术，筛查鉴定及验证CP中锯毒性差异表达的关键 蛋白，并在细胞水平进一步揭示抑制素蛋白（PHB1）在镭所致CP上皮细胞周期阻滞效应中的调控 作用机制。通过本研究将从脉络丛这个新视点为锯神经毒性作用的分子机制理论增加新的认识，为 锈中毒的早期防治提供新的思路。材料和方法：（1）镒中毒大鼠模型的建立：雄性SD大鼠随机分为6个实验组：30d染毒组与对照组, 90d染毒组与对照组，90d染毒+30d恢复期与对照组。染毒组腹腔注射MnC12, 6mg（Mn）/kg（bw）d 对照组予以生理盐水。（2）透射电镜等验证模型中镒对CP的病理损伤。（3）差异蛋白组学方法: 2D-PAGE 结合 Nano-LC-MS/MS 鉴定 CP 中镒毒性差异谱。（4） Western Blot 及 Real time RT PCR 验 证镒差异蛋白。（5） siRNA及转染技术建立PHB1敲低型细胞系。（6）流式细胞术测定细胞周期。结果和结论：（1）以2-DE结合nanoLC-IT-MS的方法在CP中鉴定到了 32个镒毒性病程相关的差异蛋白质，其 中有27个上调蛋白，5个下调蛋白。GO分类分析后发现差异表达蛋白主要分布在线粒体、膜表面 以及细胞质内，以结合、催化活性以及转运功能为主，参与代谢与转运等生物学过程。（2）对6个 差异蛋白进行体内外实验验证，证实了通过差异蛋白组学技术获得的大鼠脑脉络丛组织中镒毒性差 异表达蛋白PHB1、6actin、STIP1和TTR的变化趋势结果是可靠准确的。（3）铺作用于大鼠永生 化的脉络丛上皮细胞Z310可引起PHB1时间依赖性和剂量依赖性的上调。（4）铺引起野生型Z310 细胞以及空载体转染对照细胞在G1/S期的阻滞，但不引起PHB1敲低Z310细胞的周期阻滞，说明 PHB1在镒致Z310细胞周期阻滞效应中具有调控作用。这为今后进一步在动物整体水平研究PHB1 调控的CP细胞周期阻滞与锦引起的多巴胺神经元损伤之间的关系，以及在锦暴露人群中探索锦中 毒的早期潜在标志物及干预靶点提供必要的实验及理论依据。